Phương pháp định danh vi sinh vật

[Hoàng Đức Minh]

Định danh vi sinh vật là một vấn đề rất khó, mỗi loại vi sinh vật lại có một phương pháp định danh khác nhau. Có một bài viết tuy rất sơ lược về định danh vi khuẩn nhưng có thể tham khảo được là http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiem-dinhtenvk.htm .

Trước đây việc làm môi trường để định danh vi sinh vật làm tốn rất nhiều công sức, thời gian, và yêu cầu rất nghiêm ngặt, mỗi loại lại có một yêu cầu riêng, với ngành này thì theo em được biết tài liệu tiếng Việt hầu như không có. Ai có thể giới thiệu cho em thêm vài quyển được không ạ?

Những cuốn em có trong tay toàn cách đây 30-40 năm rồi, cuốn gần đây nhất là từ năm 1991 .

 

[Bùi Thúy Nga]

Giới thiệu với Minh phần mềm KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM VI SINH do BS. Phạm Hùng Vân và Th.S Phạm Thái Bình biên soạn gồm 04 phần.

Phần I: ? ? ? ? ? KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM VI SINH TRÊN CÁC BỆNH PHẨM
Phần II: ? ? ? ? ?MỘT SỐ KỸ THUẬT KHÁC TRONG XÉT NGHIỆM VI SINH
Phần III: ? ? ? ? KỸ THUẬT ĐỊNH DANH
Phần IV: ? ? ? ? KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ

Hiện nay, phần I và II đã hoàn thành và cung cấp thị trường.

Phần III và IV đang biên soạn

Trong Phần III sẽ trình bày phương pháp định danh các nhóm vi khuẩn kèm theo đó là hình ảnh và nguyên tắc của các thử nghiệm định danh. Hy vọng trong khoảng 03 tháng nữa sẽ hoàn thành.

Nếu khi đó, bạn cần thì có thể liên hệ Công ty TNHH Nam Khoa (793/58 trần xuân sọan -Q7 ).

Ngoài ra, hiện nay công ty có phần mềm SCM, trong phần mềm này cho phép nhập kết quả thử nghiệm và phần mềm biện luận kết quả định danh. Nhược điểm của phần mềm này là không trình bày các nguyên tắc, cách thức tiến hành một thử nghiệm định danh.

(Trích từ bài của Th.S PTB)

 

[Hoàng Đức Minh]

Mình chưa nhìn thấy phần mềm đó và chưa sử dụng bao giờ cả.

Giá là bao nhiêu thế? Có bản dùng thử ko?

Trong Phần III sẽ trình bày phương pháp định danh các nhóm vi khuẩn kèm theo đó là hình ảnh và nguyên tắc của các thử nghiệm định danh

Mức độ định danh chỉ dừng lại ở phương pháp hay là có protocol (thường quy) hoặc sop cụ thể . Có cách pha từng loại môi trường để định danh ko?

 

[Nguyễn Vũ Sơn]

có ai biết phưong pháp định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử không (PCR)?

 

[Trần Hoàng Dũng]

http://www.msu.edu/~debruijn/dna1-4.htm

 

[Nguyễn Thị Phương Thảo]

Nếu bạn muốn định danh vsv ở mức độ "species" mà không muốn gặp phải nhiều phiền toái trong việc tìm kiếm phương pháp và pha hóa chất, công ty Biomerieux có bán các kít định danh API rất đáng tin cậy. Tất nhiên không định danh hết tất cả các VSV nhưng rất rất nhiều. Thảm khảo thêm website của công ty:
http://biomerieux-usa.com/

 

[Hoàng Đức Minh]

Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật
?
?Trong vi sinh vật, PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn.


Trong vi sinh vật, PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn. Có thể kể tóm tắt một số ứng dụng chính của PCR trong Vi sinh vật học như sau:

1. Xác định cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng.

Cǎn cứ vào các đặc điểm (tính trạng) thường gặp nhất của các vi sinh vật được quan tâm, người ta tìm đến các gen quyết định các tính trạng đó, thiết kế một bộ gen mồi (primer) phù hợp nhằm để khuyếch đại một vùng ổn định nào đó trên bộ gen nói trên. Sản phẩm của quá trình khuyếch đại sau này, vì vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay từ giai đoạn này.

Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide bổ sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase. Đoạn ADN đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần; sau quá trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn ADN này, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di, nếu có bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng nào xuất hiện hoặc có những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm.

Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình:

• Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn:

. Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.

Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm.

Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2) hoặc một đoạn 419-bp (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Bằng cách đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm và chính xác.

. Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy.

Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5). Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh.

. Vi khuẩn lao:

Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá trị phục vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều. Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 105 vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính).

PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này. Nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó khǎn.

Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để coi một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB. Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài.

. Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự của Y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày.

Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó. PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định.

. Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR.

. Amíp:

Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp không gây bệnh (6).

. Vi rút:

Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành công bằng PCR.

Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang.

• Xác định độc tố của vi sinh vật:

Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia Coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. côli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy.

PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn.

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG).

Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR.

• Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:

Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể được tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae.

Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao. Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn.

Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống.

Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác.

2. Định loại (identification) vi khuẩn

Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại chúng.

Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ.

3. Phân loại (classification) vi khuẩn

Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Grimpel E, Sanchez PJ. et al. Use of polymerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid, fetal and neonatal sera and cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 29: 1711 - 1718, 1991.
2. Rosa PA and Schuan TG. A specific and sensitive assay for the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi using polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 160: 1018 - 1029, 1989.
3. Wise DJ and Weave TL. Detection of Lyme disease bacterium. Borrelia burgdorferi, by using the polymerase chain reaction and a nonradioisotopic gene probe. J. Clin. Microbiol. 29: 1523 - 1526, 1991.
4. Mahony JB. et al. Multiplex polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J. Clin. Microbiol. 33: 3049 - 3053, 1995.
5. Mahony JB. et al. Detection of Chlamydia trachomatis. Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma urealyticum, and Mycoplasma genitalium in first-void urine specimens by multiplex polymerase chain reaction. Mol. Diagn. 2 (3): 161 - 168, 1997.
6. Tachibana H, Ihara S and Kobayashi S, Et al. Differences in genomic DNA sequences between pathogenic and nonpathogenic isolates of Entamoeba histolytica identified by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29: 2234 - 2239, 1991.
7. Yokosuka O, Tagawa M and Omata M. Polymerase chain reaction. detection of hepatitis B. Viral pathogens. 322 - 326. 1992.
8. Baginski I, Ferrie A. et al. Detection of Hepatitis B virus.. In: Innis MA, Gelfand DH et al (Eds). A guide to methods and applications. Academic Press, Inc. Harcount Brace Jovanovich Pub. 348 - 355, 1990.



Lê Văn Phủng
Update 7/8/2004

http://www.hmu.edu.vn/tiengviet/content.asp?Code=561&id=NetTraining&idlg=Vietnam

 

[Phan Minh Duy]

Bài viết khen nhiều quá. Một bài viết nên có đánh giá khách quan một chút, trình bày được điểm mạnh thì cũng nên chú trọng đến điểm yếu, nhất là với PCR thì có điểm yếu chứ không phải là hoàn mỹ. Bài có trình bày được một đoạn về điểm yếu, mà theo tôi, chưa đủ và chưa thật chính xác.

Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác.

...

Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ.

- đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền: không còn quá đắt và ngày càng rẻ hơn
- cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định: một kĩ thuật viên bình thường trong bệnh viện, đào tạo chừng 1 tuần đến 1 tháng là hoàn toàn làm được vậy thì đâu phải là khó so với nhiều kĩ thuật y khoa khác.
- kỹ thuật thực hiện còn phức tạp: mơ hồ quá

Vấn đề chủ yếu của PCR khiến cho tới nay nó vẫn chỉ ở mức bổ sung chứ không thay thế được các phương pháp kinh điển trong chẩn đoán cận lâm sàng là vì:

- Độ nhạy cao nên khả năng bị tạp nhiễm cao, cho ra kết quả dương tính giả, nếu đặt quyết định điều trị lên một phương pháp có khả năng dương tính giả cao thì thật là nguy hiểm.

- Để tránh tạp nhiễm thì đòi hỏi phải có thiết kế phòng thí nghiệm phù hợp (phòng xử lý mẫu, phòng tách chiết DNA, phòng pha mix (nếu tự pha) và đặt PCR, phòng điện di), vấn đề này không còn nằm trong phạm vi của trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng vì nó liên quan đến thiết kế và quản lý phòng thí nghiệm cũng như thói quen làm việc và trật tự làm việc (work-flow) của nhân viên.

- PCR bản thân nó không khó, cái khó là khi ứng dụng lên mẫu bệnh phẩm, ngoài DNA thì còn có vô số chất khác không kiểm soát được, chỉ cần một trong các chất đó ức chế được PCR sẽ cho kết quả âm tính giả. Thường vấn đề này chủ yếu là gây rắc rối cho các nghiên cứu viên khi thiết lập qui trình, cần phải khảo sát thật kĩ cách thu mẫu và cách xử lý từng loại mẫu khác nhau. Tuy nhiên, đã nói là mẫu sinh học, khả năng có một chất lạ là không thể loại trừ được, nên nguy cơ âm tính giả vẫn còn (dù là thấp).

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Một nhược điểm nữa của PCR là phát hiện cả vi sinh vật "sống" và "chết", có nghĩa là đôi khi vi sinh vật trong mẫu phân tích đã bị "tiêu diệt", không gây hại nữa nhưng vẫn cho kết quả dương tính khi phân tích bằng PCR.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Một nhược điểm nữa của PCR là phát hiện cả vi sinh vật "sống" và "chết", có nghĩa là đôi khi vi sinh vật trong mẫu phân tích đã bị "tiêu diệt", không gây hại nữa nhưng vẫn cho kết quả dương tính khi phân tích bằng PCR.

Ý của Hưng đúng nhưng Hưng có thể cho ví dụ cụ thể hơn được k? tôi cảm thấy việc này ko quan trọng lắm.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Ý của Hưng đúng nhưng Hưng có thể cho ví dụ cụ thể hơn được k? tôi cảm thấy việc này ko quan trọng lắm

Quan trọng chứ anh. Ví dụ:

Một lô thực phẩm chuẩn bị xuất xưởng. Lấy mẫu kiểm tra khả năng nhiễm tạp vsv gây bệnh. Kết quả dương tính --> đổ cả lô sản phẩm đi, vậy có quan trọng không?

Một bệnh nhân được xét nghiệm khả năng mắc bệnh do vsv gây ra, lấy mẫu nước tiểu hoặc phân hoặc ... để phân tích bằng PCR. Kết quả dương tính --> phác đồ điều trị sai, càng nguy hiểm.

Khi mà thực tế chỉ có xác của vsv này hoặc thậm chí là không có cả xác mà chỉ có genome của nó thôi.

 

[Trần Hoàng Dũng]

Một nhược điểm nữa của PCR là phát hiện cả vi sinh vật "sống" và "chết", có nghĩa là đôi khi vi sinh vật trong mẫu phân tích đã bị "tiêu diệt", không gây hại nữa nhưng vẫn cho kết quả dương tính khi phân tích bằng PCR.

Thế bạn có biết thời gian tồn tại của DNA geneomic khi tế bào chết là bao lâu kô? do đó tb chết tồn tại trong mẫu vật thời gian lâu, có thể sẽ kô ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

Trong vi sinh vật, PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn

Câu này lại thiếu chữ học sau chữ "Trong vi sinh vật "

- dùng PCR để xác định căn nguyên bệnh nhiễm trùng và phân loại thì ok, còn dùng PCR để tìm hiểu cơ chế gây bệnh thì e là hơi ... đế cao PCR quá đáng.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Thế bạn có biết thời gian tồn tại của DNA geneomic khi tế bào chết là bao lâu kô?

Sau khi tế bào chết, DNA đứng trước nguy cơ của nuclease, các chất oxi hóa, alkyl hóa, sự tấn công của các vsv khác, nhiệt độ, pH... Vì vậy, khả năng tồn tại của DNA genomic (sau đây gọi tắt là DNA) sau khi tế bào chết phụ thuộc vào các yếu tố trên.

Trong điều kiện thuận lợi, DNA có thể tồn tại hàng chục ngàn năm sau khi tế bào chết. Bằng chứng là hiện người ta đã thành công trog việc thu nhận DNA từ các mẫu hóa thạch, trên diễn đàn này cũng có 1 bài về nhân thành công DNA từ loài gấu cổ đã tuyệt chủng (nằm quanh quẩn đầu đây).

Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra DNA có khả năng tồn tại khá lâu trong đất (tôi không nhớ cụ thể là bao lâu), nhất là đất ẩm có pH trung tính.

do đó tb chết tồn tại trong mẫu vật thời gian lâu, có thể sẽ kô ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

Khó mà trả lời câu hỏi này vì rất nhiều yếu tố kể trên. Tế bào chết có thể không tồn tại trong mẫu vật nhưng DNA của nó thì có và ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

 

[Phan Minh Duy]

Quan ngại bạn Hưng nêu ra về PCR không phân biệt được tế bào chết và tế bào sống là hoàn toàn hợp lý. Nhưng đứng trên quan điểm ứng dụng PCR để chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh trong bệnh phẩm (sinh phẩm lấy từ người bệnh) thì có một số lý do để ít quan tâm đến nhược điểm này hơn mấy nhược điểm mà tôi đã kể:

- PCR chẩn đoán thường ứng dụng để xác định/kiểm chứng (so với pp truyền thống) nhanh VSV gây bệnh. Thời điểm cần kết quả thường là giai đoạn phát bệnh (có triệu chứng), nên việc DNA còn tồn tại lâu sau khi VSV đã chết không được đặt thành vấn đề ở đây.

- Đối với những chẩn đoán để xác định có nhiễm hay không, chỉ cần có vết của DNA vi khuẩn tức là đã nhiễm, thông thường đối với vi sinh vật gây bệnh cần nhận biết bằng PCR, đã nhiễm không tự hết được.

- Có những phương pháp cũng gặp vấn đề tương tự như phương pháp xét nghiệm siêu vi B bằng kháng thể, thì chỉ kết luận được là đã từng tiếp xúc với siêu vi B, mà không nói được là hiện đang có virus trong người hay không. Cách khắc phục, PCR hay RT-PCR. RT-PCR thường được coi như là pp để khắc phục nhược điểm này của PCR, nhưng nó liên quan thêm một bước nữa và nếu làm không khéo khả năng ngoại nhiễm và nhiễm chéo giữa các mẫu còn cao hơn PCR, nên ?không được ưu chuộng bằng. Và như hai lý do trên đã nêu, vì mục tiêu cụ thể đôi khi không cần quan tâm đến điểm này.

Đáng lẽ tôi phải nói rõ hơn ở lần trước là tôi trình bày nhược điểm của PCR trên quan điểm dùng để chẩn đoán vi sinh gây bệnh, vấn đề mà tôi từng làm và quan tâm. Tuy nhiên nếu không có thiếu sót đó thì làm sao có được đóng góp của bạn Hưng. Theo tôi đó chính là cái hay khi nêu ý kiến trên diễn đàn, mình sẽ biết được về cùng một vấn đề theo nhiều khía cạnh, nhiều quan điểm từ những người có chuyên môn khác nhau.

Để bàn thêm về sự tồn tại của DNA sau khi tế bào chết, vì đây là mục nói về vi sinh nên mạn phép không bàn tới các tế bào chết do apotosis ở eukaryote, tôi có liếc sơ một số tài liệu (không nhiều) nên viết thêm lên đây để mọi người cùng bàn bạc.

Tùy vào khu vực trong cơ thể mà DNA của vi khuẩn thời gian tồn tại dài hay ngắn. Ở các khớp động, thời gian tồn tại của DNA vi khuẩn (PCR dương tính) có thể kéo dài đến 20 ngày sau khi nuôi cấy không còn cho kết quả dương tính [1]. Trong huyết thanh, DNA vi khuẩn có thế tồn tại đến 72 giờ [2] (tuy nhiên trong nghiên cứu này tôi không chắc là 72 giờ sau khi vi khuẩn chết - chưa có thời gian đọc kĩ chỉ lướt qua abstract).

Ở ngoài môi trường (tức không ở trong cơ thể người/vật), tùy nhiều yếu tố như đã có bạn đề cập ở trên mà DNA có độ bền khác nhau. Một nghiên cứu có thấy độ bền tối đa của DNA là khoảng 400-600 ngàn năm (kyr) [3]. Các DNA cổ được tìm thấy có thể kể đến DNA ty thể của mammoth (hơn 50 kyr), DNA ty thể bò bison (hơn 65 kyr), DNA lục lạp (300-400 kyr) và DNA vi khuẩn (400-600 kyr).



[1]Ineke M. Van Der Heijden et al. Arthritis & Rheumatism (2001)
[2] Rubén Francés et al. Hepatology (2004)
[3] Eske Willerslev et al. Curr. Biol. (2004); ?Eske Willerslev et al. Proc. R. Soc. B (2005)

 

[Trần Hoàng Dũng]

như vậy chúng ta cần khu trú thảo luận này lại ở chỗ dùng PCR để xác định bệnh phẩm chứ kô phải cho đồ hộp hay voi ma-mut ướp lạnh. Go ahead!

Tùy vào khu vực trong cơ thể mà DNA của vi khuẩn thời gian tồn tại dài hay ngắn. Ở các khớp động, thời gian tồn tại của DNA vi khuẩn (PCR dương tính) có thể kéo dài đến 20 ngày sau khi nuôi cấy không còn cho kết quả dương tính [1]. Trong huyết thanh, DNA vi khuẩn có thế tồn tại đến 72 giờ [2] (tuy nhiên trong nghiên cứu này tôi không chắc là 72 giờ sau khi vi khuẩn chết - chưa có thời gian đọc kĩ chỉ lướt qua abstract).

đấy là điều tui thắc mắc, thanks

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Đáng lẽ tôi phải nói rõ hơn ở lần trước là tôi trình bày nhược điểm của PCR trên quan điểm dùng để chẩn đoán vi sinh gây bệnh, vấn đề mà tôi từng làm và quan tâm.

Cần rõ thêm là chẩn đoán vi sinh gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm nữa ạ. Đúng như anh nói với trường hợp chẩn đoán vsv gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm thì nhược điểm "sống-chết" ?không quan trọng nhưng nếu chẩn đoán vsv gây bệnh trong mẫu thực phẩm thì rất quan trọng.

Quay lại với vấn đề dùng PCR để chẩn đoán vsv gây bệnh, các yếu tố quan trọng là độ nhạy, tính đặc hiệu và thời gian tiến hành của quy trình. 3 yếu tố này có quan hệ tương hỗ với nhau, muốn nâng cao cái này thì phải hy sinh cái kia. Với từng đối tượng mà người ta chọn yếu tố chủ đạo và điều chỉnh các yếu tố còn lại cho phù hợp. Một số nghiên cứu giảm thời gian thực hiện quy trình bằng cách dùng pp boiling để tách DNA hoặc thậm chí là direct PCR không qua khâu tách DNA.

Anh Duy đã từng làm với các mẫu bệnh phẩm, anh giải quyết các yếu tố này thế nào?

 

[Phan Minh Duy]

Vâng, nói lại cho rõ mà cuối cùng vẫn không được rõ, cám ơn bạn đã bổ sung giúp tôi.

Tôi chưa có đủ kinh nghiệm để đưa ra những nhận định thật chính xác về vấn đề mà bạn hỏi, chỉ biết rằng nó phụ thuộc chủ yếu vào bản chất của vi sinh vật cần chẩn đoán và loại bệnh phẩm chứa vsv đó. Giữa độ nhạy, độ đặc hiệu và thời gian tiến hành quy trình thì để ứng dụng cho chẩn đoán cận lâm sàng (ảnh hưởng trực tiếp tới quyết định của bác sĩ) thì có thể xếp mức ưu tiên là độ đặc hiệu, độ nhạy rồi tới thời gian tiến hành.

Thà kết luận là không biết, không xác định được còn hơn đưa ra kết quả dương tính giả. Vì nếu không xác định, bs có thể quyết định chờ kết quả của ?các xét nghiệm khác, hay dựa vào phán đoán từ biểu hiện lâm sàng (thường rất hữu dụng đ/v bác sĩ nhiều kinh nghiệm) mà điều trị. Nhưng một khi kết quả xét nghiệm là dương tính với một vsv nào đó, việc điều trị sau này chủ yếu là dựa vào kết quả khẳng định đó. Chính vì vậy mà xếp độ nhạy vào hàng thứ hai, thà chấp nhận là không thể tìm ra 100% còn hơn là tìm được 100% nhưng bù lại lại kết luận dương tính giả cho nhiều ca bệnh.

Có thể vì làm PCR nên thiên vị, nhưng đã dùng PCR thì nhìn chung đều nhanh hơn những cách truyền thống. Tuy nhiên, ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy của PCR là chất lượng/hàm lượng DNA và các thành phần khác (có khả năng ức chế PCR) trong mẫu. Nhiều người khi nói đến xây dựng qui trình chẩn đoán bằng PCR thì cứ chăm chăm vào PCR, nhưng việc khảo sát để thu đúng loại mẫu, xử lý mẫu thích hợp để thu được DNA tốt và đủ nhiều gần như quyết định sự thành công của PCR. Dùng pp đun hay direct PCR (thực ra cũng đã gần như đun) hay siêu âm đều tốt cả, nhưng để nói chính xác cái nào tốt hơn thì câu trả lời của tôi là làm thí nghiệm so sánh, đôi khi kết quả thu được đem lại cho ta những ngạc nhiên thú vị.

Nói về xử lý mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA thì tôi xin nhường lại cho một ai khác trên diễn đàn có nhiều kinh nghiệm hơn, vì nó rất đa dạng mà tôi không biết hết được để có thể có một cái nhìn tổng quan về nó.

 

[Hoàng Đức Minh]

Lê Hoàn, Trần Khánh Chi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Bạch Khánh Hoà. Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần. TCNCYH 23 (3) - 2003, tr: 2-5

http://www.hmu.edu.vn/TiengViet/tapchiyh/Tapchi/b01-03-2003.pdf

 

[Trần Hoàng Dũng]

To Minh: em có ý sưu tầm tài liệu là rất tốt, rất đáng biểu dương, nhưng bây giờ em có thể đi thêm 1 bước nữa đó là trên từng bài, tài liệu em kiếm được, em nên tập đọc qua nó và có ý tưởng, ý kiến của mình về bài viết đó. Ví dụ em nhận xét đánh giá gì về bài tách DNA máu ngoại vi này???


To all: Tui chỉ muốn khóc sau khi đọc bài nc này xong. Chiếu theo quy chế phong sư của VN, tính theo tỷ lệ 1:1, bài nc này sẽ có điểm tương đương với 1 bài báo mà anh chị em ncs chúng ta làm và đăng tạp chí quốc tế.

 

[Phan Minh Duy]

Đồng ý với anh Dũng, hic, không thể ngờ một bài đăng trên tạp chí khoa học Việt Nam í ẹ đến như vậy. Nếu hóa chất có sẵn hết, tôi chỉ cần hướng dẫn cho một em SV sắp ra trường 3 ngày là có đủ kết quả và viết được 1 bài báo như vầy luôn rồi. Mẫu nghiên cứu hả, vô tư, tổng cộng hình như họ chỉ dùng có 20.2mL máu chứ nhiêu, đè thằng Sv khỏe mạnh của tôi ra rút 30mL máu là chuyện nhỏ. Còn nếu là cô sv xinh đẹp thì thằng hướng dẫn này tự rút 30mL cho cũng không hề gì hahaha...