Mồi cho phản ứng MSP

[bichphuong]

Mọi người giúp mình với. Mình không hiểu tại sao mồi cho phản ứng MSP có thể bắt cặp lên mạch khuôn đã biến đổi bisulfite được. Cụ thể

Mạch khuôn ban đầu 5'-TCA CCA GAG GGT GGG GCG GAT CGC-3'
3'-AGT GGT CTC CCA CCC CGC CTA GCG-5'

Sau biến đổi bisufite 5'-TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC-3'

3'-AGT GGT TTT TTA TTT TGC TTA GCG-5'
Chữ màu đỏ và màu xanh là những nu bị biến đổi sau khi sử lí với sodium bisulfite. Mồi trong bài báo mình tham khảo thấy trùng với trình tự DNA mạch sense. Vậy làm sao mồi có thể bắt vào mạch khuôn được khi mà C đã biến đổi thành T, và T này không thể bắt với G ở mạch bổ sung được.
Mọi người giải thích giúp mình với

 

[Ho Huu Tho]

Mọi người giúp mình với. Mình không hiểu tại sao mồi cho phản ứng MSP có thể bắt cặp lên mạch khuôn đã biến đổi bisulfite được. Cụ thể

Mạch khuôn ban đầu 5'-TCA CCA GAG GGT GGG GCG GAT CGC-3'
3'-AGT GGT CTC CCA CCC CGC CTA GCG-5'

Sau biến đổi bisufite 5'-TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC-3'

3'-AGT GGT TTT TTA TTT TGC TTA GCG-5'
Chữ màu đỏ và màu xanh là những nu bị biến đổi sau khi sử lí với sodium bisulfite. Mồi trong bài báo mình tham khảo thấy trùng với trình tự DNA mạch sense. Vậy làm sao mồi có thể bắt vào mạch khuôn được khi mà C đã biến đổi thành T, và T này không thể bắt với G ở mạch bổ sung được.
Mọi người giải thích giúp mình với

T vẫn có thể bắt với G bạn ạ (mặc dù chúng không bổ sung theo quy tắc Watson-Crick), nhưng với năng lượng liên kết nhỏ hơn thôi. Bạn cần kiểm tra delta G của hai mạch khi chúng lai với nhau để biết khả năng bắt cặp của chúng.

 

[bichphuong]

Lúc đầu mình cũng nghĩ như bạn. Nhưng chiều giờ mình đã kiểm tra lại và đã phát hiện ra rằng: Khi biến đổi bisulfite thì những vị trí C không bị methyl hóa sẽ chuyển thành T vì vậy trên mồi ngược khi thiết kế sẽ phải chuyển thành A để có thể bắt lên mạch khuôn. Còn mồi xuôi thì sẽ không bắt lên mạch gốc mà sẽ bắt lên mạch mới do mồi ngược kéo dài. Cụ thể:
Đoạn gen chưa biến đổi
5'-TCACCAGAGGGTGGGGCGGACCGC........CCACGGTCGCGGCCCGGGGTC
Đoạn gen sau khi biến đổi bisulfte
5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC........TTACGGTCGCGGTTCGGGGTC
Cặp mồi methyl hóa là
Mồi xuôi: 5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC
Mồi ngược: 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA
Mồi ngược bắt vào mạch khuôn, kéo dài mạch. Sau đó mồi xuôi mới bắt vào mạch mới vừa được tổng hợp, mồi xuôi không thể bắt trực tiếp lên mạch gốc
5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC........TTACGGTCGCGGTTCGGGGTCG
3'-AATAATCTCCCACCCCGCCTAGCG........AATGCCAGCGCCAAGCCCCAGC
5'-TTATTAGCGGGTGGGGCGGATCGC........TTACGGTCGCGGTTCGGGGTCG

Mình xin nói sơ qua kỹ thuật MSP để các bạn dễ theo dõi:
MSP-Methylation Specific PCR, là một kỹ thuật dùng để khảo sát tình trạng methyl hóa của những vị trí CpG trên đảo CpG.
Methyl hóa là hiện tượng gắn thêm một gốc _CH3 vào C-5 của cytoxin. Sự methyl hóa này có một vai trò quan trọng cho sự phát triển bình thường của động vật có vú như: ức chế các oncogene, gây ra imprinting, nhiễm sắc thể X không hoạt động. Tuy nhiên khi sự methyl hóa diễn ra bất thường sẽ gây ra những biến đổi có thể dẫn tới ung thư.
Đảo CpG là những đoạn DNA tập trung nhiều CpG. CpG là những vị trí C đi liền với G
Biến đổi bisulfite: khi DNA được xử lí với Sodium bisulfite thì tất cả C không bị methyl hóa sẽ chuyển thành T, còn C bị methyl hóa sẽ không bị biến đổi
MSP là kỹ thuật PCR nhưng mạch khuôn dùng để khuếch đại là mạch DNA đã được biến đổi bisulfite. Sử dụng 2 cặp mồi được thiết kế đặc biệt là mồi methyl và unmethyl để kiểm tra. Nếu cặp mồi methyl cho kết quả thì kết luận các CpG khảo sát bị methyl hóa hoàn toàn. Nếu cặp mồi unmethyl cho kết quả thì kết luận các CpG khảo sát không bị methyl hóa. Nếu cả 2 cặp mồi cho kết quả thì các CpG khảo sát bị methyl hóa không hoàn toàn