Thắc mắc về enzym Tth DNA polymerase

[Ho Huu Tho]

Mình đọc thấy đoạn này nói về enzym Tth DNA polymerase:
Tth DNA polymerase catalyzes polymerization of nucleotides into duplex DNA in the 5′→3′ direction in the presence of MgCl2. The enzyme can use an RNA template in the presence of MnCl2 (Myers and Gelfand, 1991; Ruttimann et al. 1985). Tth DNA polymerase exhibits a 5′→3′ exonuclease activity but lacks detectable 3′→5′ exonuclease activity. The error rate of Tth DNA polymerase has been measured at 7.7 × 10–5 errors/base (Arakawa et al. 1996). Tth DNA polymerase can amplify target DNA in the presence of phenol-saturated buffer (Katcher and Schwartz, 1994) and has been reported to be more resistant to inhibition by blood components than other thermostable polymerases (Ehrlich et al. 1991; Bej and Mahbubani, 1992).


Mình hiểu không rõ ý ở phần in đậm: theo ý này thì có phải là enzym sẽ phân cắt các các primer trong phản ứng PCR không?

 

[Nguyễn Xuân Trường]

Synthesis of DNA takes place in small fragments (Okazaki pieces) to each of which is attached a primer RNA segment. The 5'-->3' exonuclease activity is also responsible for removing the RNA segment and then filling in the gap by deoxyribonucleotides. As polymerase I moves ahead it cuts off ribonucleotides in front and adds deoxyribonucleotides behind.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không phải. Những enzyme thiếu 5'-3' exonuclease ví dụ Klenow fragment thường được dùng để:
+ tạo đầu tù từ đầu dính (sau khi cắt enzyme)
+ tổng hợp probe từ random primers
Hình dung nếu nó cắt được 5'-3' tức cứ thằng nào trước mặt nó là nó xơi hết. Còn 3'-5' là để sửa lỗi (quay đầu lại).

 

[Ho Huu Tho]

Vậy tóm lại chức năng của enzym exonuclease 5´-3´ là gì, các bác có thể nói rõ thêm cho em một tí được không. Em thuộc hàng ngu lâu nên vẫn chưa hiểu gì cả

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không phải là một enzyme độc lập, mà là một tiểu phần thuộc holoenzyme DNA Pol.
Xem quá trình tổng hợp sợi chậm, đoạn Okazaki (hình vẽ).
Enzyme DNA Pol. sẽ phải nối các đoạn Okazaki với nhau. Nhưng đầu 5' của mỗi đoạn Okazaki là RNA (primer). Nó sẽ phải loại bỏ cái đoạn RNA đó để thay DNA vào. Để làm điều đó nó phải gặm dần đoạn RNA từ đầu 5' đến 3' cho đến khi gặp DNA thì thôi.
Trong một trường hợp khác, ví dụ sửa lỗi 1 đoạn DNA, nó cũng phải làm nhiệm vụ tương tự: ăn những gì trước mặt nó đồng thời tổng hợp theo chiều 5' đến 3'.

Nhớ chữ exo có nghĩa là ngoài: enzyme này phải có một chỗ đứt trên sợi đơn DNA nó mới cắt được. Trái ngược với endo nghĩa là trong: enzyme nó cắt bất cứ vị trí nào trên sợi DNA mà không cần có chỗ đứt nào cả.

 

[Ho Huu Tho]

Không phải là một enzyme độc lập, mà là một tiểu phần thuộc holoenzyme DNA Pol.
Xem quá trình tổng hợp sợi chậm, đoạn Okazaki (hình vẽ).
Enzyme DNA Pol. sẽ phải nối các đoạn Okazaki với nhau. Nhưng đầu 5' của mỗi đoạn Okazaki là RNA (primer). Nó sẽ phải loại bỏ cái đoạn RNA đó để thay DNA vào. Để làm điều đó nó phải gặm dần đoạn RNA từ đầu 5' đến 3' cho đến khi gặp DNA thì thôi.
Trong một trường hợp khác, ví dụ sửa lỗi 1 đoạn DNA, nó cũng phải làm nhiệm vụ tương tự: ăn những gì trước mặt nó đồng thời tổng hợp theo chiều 5' đến 3'.

Nhớ chữ exo có nghĩa là ngoài: enzyme này phải có một chỗ đứt trên sợi đơn DNA nó mới cắt được. Trái ngược với endo nghĩa là trong: enzyme nó cắt bất cứ vị trí nào trên sợi DNA mà không cần có chỗ đứt nào cả.

Em có thể hiểu phần giải thích của bác Lương về hoạt tính exonuclease như sau được không:
- Exonuclease cắt mạch axit nucleic (cả ADN và ARN) từ ngoài vào, trong đó:
+ exonuclease 5´-3´ cắt từ đầu 5´ vào.
+ exonuclease 3´-5´ cắt từ đầu 3´ vào.
- Exonuclease cắt được mạch đơn ADN và cắt được mạch ARN trong hybrid ADN-ARN.
- Exonuclease không cắt được mạch kép ADN

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đúng rồi đó. Chỉ có cái vụ cắt được mạch đơn DNA thì không chắc lắm.

 

[Ho Huu Tho]

Đúng rồi đó. Chỉ có cái vụ cắt được mạch đơn DNA thì không chắc lắm.

Nếu nó cắt được mạch đơn ADN thì primer trong phản ứng PCR có Tth DNA polymerase sẽ bị cắt phải không bác nhỉ, vậy làm sao nhân PCR?