Lc/ms

[peter]

em mới làm về LC/MS xin được thỉnh giáo các anh chị em về việc phân tích kết quả để tìm ra phân tử lượng của các hợp chất sau khi chạy LCMS, sau khi em chạy LC/MS để phân tích phân tử lượng của một số hợp chất thì thấy rằng có có pic cho phân tử lượng lớn hơn phân tử lượng của chất cần tìm 2 hoặc 5. cũng có pic cho phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của chất cần tìm 2 hoặc 3. anh chị em nào có kinh nghiệm trong lĩnh vực này xin chỉ giúp với ạ!

 

[Nguyễn Đôn]

em mới làm về LC/MS xin được thỉnh giáo các anh chị em về việc phân tích kết quả để tìm ra phân tử lượng của các hợp chất sau khi chạy LCMS, sau khi em chạy LC/MS để phân tích phân tử lượng của một số hợp chất thì thấy rằng có có pic cho phân tử lượng lớn hơn phân tử lượng của chất cần tìm 2 hoặc 5. cũng có pic cho phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của chất cần tìm 2 hoặc 3. anh chị em nào có kinh nghiệm trong lĩnh vực này xin chỉ giúp với ạ!

Muốn tìm m/z của chất mình cần khi chạy sắc ký lỏng có kèm phổ khối (LC-MS) thì phải tùy theo chế độ ion hóa mà bạn sử dụng (dương hay âm). Thường thì m/z khác 1 so với phân tử lượng của chất mình tìm, còn 2 với 5 thì có thể (chỉ là có thể) không phải là chất bạn muốn tìm.
- Nếu chạy với chế độ ion hóa dương (thêm proton): bạn nên tìm chất của mình bằng cách lấy phân tử lượng cộng thêm 1. Ví dụ như acid cinnamic có phân tử lượng là 148 thì mình phải nhập 149 để phần mềm phân tích số liệu tìm mũi đó cho mình.
- Nếu chạy với chế độ ion hóa âm (mất proton) thì mình phải trừ đi 1. Ví dụ tương tự cho acid cinnamic, lúc này bạn phải tìm mũi có m/z là 147.

Nếu bạn tìm nát (+1 và -1) mà vẫn không thấy chất mình tìm thì có thể hợp chất của bạn không được ion hóa với proton mà ion hóa với kalium (K+, thêm 39) hoặc chlorur (Cl-, thêm 35.5). Thường thì tìm +/-1 mà không có thì rất ít khả năng tìm thấy +39 hoặc +35.5 (vì thêm hay bớt 1 thì dễ hơn là thêm cả đống kia).

Nếu bạn nghi ngờ các mũi có m/z hơn kém 2 hoặc 5 kia là hợp chất của bạn cần tìm thì bạn xem thử phổ khối (MS) của nó xem trong phổ có mũi nào mang m/z +/-1 so với phân tử lượng cần tìm hay không. Đôi khi trong phổ khối, mũi này rất nhỏ so với mũi +/-2 hay +/-5 kia nên bạn không dò ra được. Nếu bạn tìm thấy mũi +/-1 nhỏ thì thay đổi năng lượng ion hóa của máy LC-MS để có tín hiệu tốt hơn (mũi +/-1 lớn hơn).

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hình như chỉ có MALDI mới ion hóa +/-1 còn mấy cái ion hóa khác có thể hơn +/- 1 chứ nhỉ?

 

[peter]

Muốn tìm m/z của chất mình cần khi chạy sắc ký lỏng có kèm phổ khối (LC-MS) thì phải tùy theo chế độ ion hóa mà bạn sử dụng (dương hay âm). Thường thì m/z khác 1 so với phân tử lượng của chất mình tìm, còn 2 với 5 thì có thể (chỉ là có thể) không phải là chất bạn muốn tìm.
- Nếu chạy với chế độ ion hóa dương (thêm proton): bạn nên tìm chất của mình bằng cách lấy phân tử lượng cộng thêm 1. Ví dụ như acid cinnamic có phân tử lượng là 148 thì mình phải nhập 149 để phần mềm phân tích số liệu tìm mũi đó cho mình.
- Nếu chạy với chế độ ion hóa âm (mất proton) thì mình phải trừ đi 1. Ví dụ tương tự cho acid cinnamic, lúc này bạn phải tìm mũi có m/z là 147.

Nếu bạn tìm nát (+1 và -1) mà vẫn không thấy chất mình tìm thì có thể hợp chất của bạn không được ion hóa với proton mà ion hóa với kalium (K+, thêm 39) hoặc chlorur (Cl-, thêm 35.5). Thường thì tìm +/-1 mà không có thì rất ít khả năng tìm thấy +39 hoặc +35.5 (vì thêm hay bớt 1 thì dễ hơn là thêm cả đống kia).

Nếu bạn nghi ngờ các mũi có m/z hơn kém 2 hoặc 5 kia là hợp chất của bạn cần tìm thì bạn xem thử phổ khối (MS) của nó xem trong phổ có mũi nào mang m/z +/-1 so với phân tử lượng cần tìm hay không. Đôi khi trong phổ khối, mũi này rất nhỏ so với mũi +/-2 hay +/-5 kia nên bạn không dò ra được. Nếu bạn tìm thấy mũi +/-1 nhỏ thì thay đổi năng lượng ion hóa của máy LC-MS để có tín hiệu tốt hơn (mũi +/-1 lớn hơn).

Em chạy LCMS với chế độ ion hóa +. đúng là em đang nghi ngờ các mũi hơn kém 2, 3 hoặc 5 kia là chất em cần tìm. em đã tìm trong phổ của các peak này thì đúng là có mang m/z +1 so vớ phân tử lượng của chất cần tìm, tuy nhiên độ cao của các peak này thấp hơn rất nhiều so với độ cao của các peak trên , vậy vì sao lại sảy ra trường hợp này va làm sao để khắc phục để đưa ra kết quả đẹp đẹp một chút ạ?

 

[Nguyễn Đôn]

Nghe bạn kể thì tôi đoán bạn đang phân tích chất có phân tử lượng nhỏ (như hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật). Còn nếu bạn làm protein thì mấy kinh nghiệm của tôi chắc không xài được.

Em chạy LCMS với chế độ ion hóa +. đúng là em đang nghi ngờ các mũi hơn kém 2, 3 hoặc 5 kia là chất em cần tìm. em đã tìm trong phổ của các peak này thì đúng là có mang m/z +1 so vớ phân tử lượng của chất cần tìm, tuy nhiên độ cao của các peak này thấp hơn rất nhiều so với độ cao của các peak trên , vậy vì sao lại sảy ra trường hợp này va làm sao để khắc phục để đưa ra kết quả đẹp đẹp một chút ạ?

Thường khi bị phân mảnh, hợp chất sẽ cho ra các mũi có m/z nhỏ hơn phân tử lượng ban đầu. Những mũi có m/z nhỏ hơn 2 hoặc 3 thì có thể do phân mảnh mà ra, còn mũi có m/z hơn thì thường không có, hoặc có thể do "nhiễm" từ dung môi vào.
Để kiểm tra, bạn so sánh phổ của mũi đó với phổ nền (phổ của phần không có mũi nào hết trong sắc phổ). Phần mềm phân tích có chức năng "loại trừ" (subtract) giữa hai phổ này. Nếu mũi có m/z hơn đó là từ dung môi hay nhiễm ở đâu đó thì sẽ không xuất hiện sau khi loại trừ.

Nếu hợp chất mà bạn đang nghi ngờ là đúng thì mũi m/z +1 kia có thể bị "bắn phá" hơi nặng tay trong quá trình phân mảnh nên mới có tín hiệu thấp như vậy. Để mũi m/z +1 cao hơn, bạn có thể giảm năng lượng ion hóa và năng lượng phân mảnh (tên gọi khác nhau tùy theo loại máy LC-MS, Hãng Agilent thì gọi là "fragmentor" và "collision-induced dissociation"). Nếu hai giá trị năng lượng này quá cao, ion mẹ (ion có m/z +/-1 so với phân tử lượng) sẽ bị phá và có tín hiệu thấp. Bạn phải chạy vài lần với hai giá trị này khác nhau để có phổ "đẹp".

Hình như chỉ có MALDI mới ion hóa +/-1 còn mấy cái ion hóa khác có thể hơn +/- 1 chứ nhỉ?

Tùy bản chất của hợp chất đem phân tích mà nó bị ion hóa +/-1 hay cao hơn. Thường thì ion hóa cao hơn 1 sẽ rất khó, phân tử đã bị mất (hay thêm) điện tích thì rất khó bị âm thêm hay dương thêm. Thường thì chỉ những chất có phân tử lượng lớn như protein hay các polymer khác mới bị ion hóa hơn +/-1.
Nếu thực sự hợp chất đó bị ion hóa hơn +/-1 thì m/z sẽ không chỉ khác phân tử lượng 2 hoặc 5 mà khác rất nhiều vì phổ khối không thể hiện khối lượng của các mảnh ion mà thể hiện tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z).

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Mình muốn hỏi có thể do C13/C12 không nhỉ? Mặc dù thường thì C12 phải chiếm peak lớn.

 

[peter]

đúng là các chất mà em cần phân tích chỉ có phân tử lượng trong khoảng 170-300,không phải protein. nhân tiện em muốn hỏi thêm là trong trường hợp có một số peak với thời gian lưu là khác nhau nhưng cho m/z lại giống nhau, vậy làm sao đẻ khắc phục hiện tượng này ạ? một số peak lại cho ra rất nhiều m/z (phải đến tầm trên 20 m/z)ạ, không biết là hiện tượng này do những nguyên nhân gì gây ra ạ?
em mới làm về lĩnh vực này nên chưa có kinh nghiệm ạ, không biết anh chị em có tài liệu nào về lĩnh vực này có thể chia sẻ cho em vói ạ?

 

[Nguyễn Đôn]

trong trường hợp có một số peak với thời gian lưu là khác nhau nhưng cho m/z lại giống nhau, vậy làm sao đẻ khắc phục hiện tượng này ạ? một số peak lại cho ra rất nhiều m/z (phải đến tầm trên 20 m/z)ạ, không biết là hiện tượng này do những nguyên nhân gì gây ra ạ?
em mới làm về lĩnh vực này nên chưa có kinh nghiệm ạ, không biết anh chị em có tài liệu nào về lĩnh vực này có thể chia sẻ cho em vói ạ?

Các mũi ở thời gian lưu khác nhau nhưng m/z giống nhau là chuyện bình thường. Vì một chất có phân tử lượng lớn có thể bị phân mảnh và trong phổ khối có mảnh m/z trùng với m/z của ion mẹ của chất có phân tử lượng nhỏ hơn. Điều quan trọng là bạn tìm được m/z của ion mẹ (m/z lớn nhất), rồi nhìn các m/z khác trong phổ để đoán chất mình cần tìm.
Trường hợp lý tưởng nhất là chạy chất chuẩn, sau đó so sánh thời gian lưu và phổ của chất chuẩn với mũi của chất mình đang quan tâm.

Số lượng mảnh ion trong phổ khối khác nhau là tùy bản chất của từng chất. Những chất dễ bị phân mảnh thì sẽ tạo ra nhiều mảnh m/z trong phổ của nó. Những chất khác thì cứ "trơ gan cùng tuế nguyệt" nên chỉ có m/z của ion mẹ xuất hiện (cả phổ chỉ có một giá trị m/z, những giá trị khác có cường độ không đáng kể).
Ngay cả cùng một chất, nếu bạn tăng mức năng lượng ion hóa (fragmentor) và năng lượng bắn phá (collision-induced dissociation) lên thì chất đó sẽ cho ra nhiều mảnh m/z trong phổ hơn là khi các năng lượng này thấp.
Phổ lý tưởng là phổ có số m/z với cường độ tương đối "đẹp", không ít quá, cũng không được "nát" quá. Người ta thường điều chỉnh hai giá trị năng lượng ion hóa và bắn phá để có phổ "đẹp". Phổ "nát" quá thì khó thấy ion mẹ, còn phổ "đơn điệu" quá thì không thể so sánh giữa hai chất để xem phổ của nó có giống nhau không (phổ giống nhau thì là cùng một chất hoặc có cấu trúc rất giống nhau).

Các tài liệu về phổ khối có khá nhiều trên mạng, bạn chỉ cần tra là ra. Đặc biệt là các công ty như Agilent hay Waters thường sẽ có các bản hướng dẫn sử dụng rất kỹ càng cho các loại máy này.

Mình muốn hỏi có thể do C13/C12 không nhỉ? Mặc dù thường thì C12 phải chiếm peak lớn.

Đúng như anh nói là các đồng vị sẽ tạo ra các mũi hơn kém phân tử lượng bình thường và chỉ chiếm lượng nhỏ.
Trong trường hợp của bạn "peter" mô tả thì các mũi này lại có tín hiệu khá cao, do đó mình không nghĩ là do C13.

 

[peter]

em muốn hỏi một chút về trường hợp tính toán khối lượng phân tử của chất sau khi chạy LC-MS.
theo anh, chi trong khi tính toán khối lượng phân tủ của chất sau khi chạy LC-MS + cần chú ý những gì ạ?
vừa rồi em có phân tích một số peak sau khi chạy LC-MS + thì thấy có trường hợp m/z là M + H, M+ K, M+NH4, M+Na thì cho khối lượng phân tử của chất cần tìm, tuy nhiên lại có trường hợp khi tính phải nhìn nhận m/z là M+H+H, M+H+NH4, M+K+NH4 thì mới khớp với phân tủ lượng của chất cần. vậy trong trường hợp này minh nhìn nhận vấn đề như thế nào cho đúng ạ?