Rắc rối với băng vạch điện di

[ngaytho]

Các bác ơi, em cần nhân lên đoạn gen dài 100bp. Sau khi nhân lên kiểm tra trên gel điện di thấy cả mẫu chứng âm (không cho template) cũng lên băng giống hệt như mẫu chuẩn, nên em nghi ngờ là sản phẩm mong muốn của em chưa được nhân lên? Song em cũng không rõ băng đó là mồi nhân lên hay chỉ là tracking dye? Các bác giải thích giùm em với.

 

[Ho Huu Tho]

Các bác ơi, em cần nhân lên đoạn gen dài 100bp. Sau khi nhân lên kiểm tra trên gel điện di thấy cả mẫu chứng âm (không cho template) cũng lên băng giống hệt như mẫu chuẩn, nên em nghi ngờ là sản phẩm mong muốn của em chưa được nhân lên? Song em cũng không rõ băng đó là mồi nhân lên hay chỉ là tracking dye? Các bác giải thích giùm em với.

Bạn post ảnh gel lên đây đi, và nói rõ trong chứng âm có những gì trong đó. Bạn dùng ladder bao nhiêu đấy? Đây là cặp mồi bạn chạy lần đầu hay đã chạy từ trước rồi?

 

[ngaytho]

Chứng âm của em gồm mồi, Taq pol, dNTP, đệm (nói chung có đủ cả chỉ thiếu khuôn thôi). Em dùng 100bp DNA ladder. Cặp mồi này là em chạy thử lần đầu tiên ạ, nên em mới không chắc. Sorry, em chưa biết cách post hình ảnh lên ạ. Nói chung 2 băng giống y nhau giống gần trùng với vạch 100bp ạ.

 

[peter]

Các bác ơi, em cần nhân lên đoạn gen dài 100bp. Sau khi nhân lên kiểm tra trên gel điện di thấy cả mẫu chứng âm (không cho template) cũng lên băng giống hệt như mẫu chuẩn, nên em nghi ngờ là sản phẩm mong muốn của em chưa được nhân lên? Song em cũng không rõ băng đó là mồi nhân lên hay chỉ là tracking dye? Các bác giải thích giùm em với.

Đoạn gene mà bạn cần nhân lên là tương đối nhỏ (100bp), nếu mồi bạn thiết kế nằm trong khoảng (20-35bp) thì sự chênh lệch giữa độ dài mồi và gene đích là không nhiều. Cần lưu ý mồi thì không thể tự nhân lên nếu như không có template. Bạn nên kiểm tra lại kết quả bằng việc sử dụng Macker kiểm tra có thang độ bé để dễ phân biệt độ dài của gene đích và mồi. Good luck

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thế coi chừng tràn giếng từ mẫu sang, hoặc nhiễm mẫu. Còn nghi ngờ thì chạy lại thôi có gì đâu. Nhưng nhớ cất cái sample đã thành công đi, đừng vất.

 

[Ho Huu Tho]

Không có ảnh điện di thì mình thấy hơi khó để nhận định kết quả.
Để phân biệt sản phẩm nhân lên là do dimer của mồi hay sản phẩm thì có thể so với ladder. Nếu có ladder 50 bp để điện di là tốt nhất, lúc đó bạn sẽ nhận định kích thước của sản phẩm nhân lên tốt hơn. Nếu không có, bạn nên điện di lâu hơn một chút để xem sản phẩm thu được dài hơn hay ngắn hơn 100 bp. Nếu dài hơn 100 bp thì khó có khả năng là dimer lắm, lúc đó sẽ kiểm tra khả năng bị nhiễm không. Lượng ADN template bạn dùng để chạy là bao nhiêu vậy, PCR thường hay có thiết kế gì đặc biệt không?

 

[ngaytho]

Cảm ơn các bác đã gợi ý. Em cũng vừa thử điện di mồi (trộn mồi xuôi với mồi ngược) thì thấy băng cũng giống như mẫu PCR của em mới lạ chứ. Chắc tại gel em phân tách chưa tốt. Thực ra gene em cần nhân là 84bp (mồi PCR có chèn đoạn giới hạn nên mới thành 100bp). Thôi thì em sẽ cố làm lại xem rốt cục sản phẩm có được nhân lên không.
Ảnh điện di của em: 2 băng bên trái ạ (đầu tiên là chứng âm, cái thứ 2 là mẫu chuẩn) dùng 100bp ladder marker.
________________________
I am just innocent in my field!

 

[ngaytho]

Ảnh của em đây ạ.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thế thì bạn chạy lâu chút nữa và tăng nồng độ gel lên. Chạy 1/2 Voltage so với bình thường ấy (khoảng 60 Vol).

 

[Ho Huu Tho]

Ý kiến của mình là: Có thể xem xét tới khả năng điện di agarose 2%, hạ nhiệt độ gắn mồi và tăng lượng template, giảm chu kỳ của PCR. Nhưng mình không biết cụ thể bạn đã làm thế nào nên cũng khó nói. Chưa có ladder 50bp thì dùng tạm cái 100bp, nhưng cần chạy càng lâu càng tốt miễn là đừng để nó chạy ra khỏi gel.

 

[biopass]

Cho nồng độ agarose lên 3% chạy khoảng 60 v. thời gian thì các bác đã nói rồi,làm sao cho băng kô ra ngoài là được.