Cần trợ giúp gấp-PCR với template là plasmid

[VET]

Mình đang làm thí nghiệm với một plasmid Phw2000 để nhân và tái tổ hợp gene của vi rút cúm. Mình muốn dùng plasmid đã có insert rồi làm khuôn và chạy PCR lấy toàn bộ Plasmid ở dạng mạch thẳng, trong đó mỗi đầu chứa khoảng 12-13 nucleic của viruts cúm. Mình đã có sequence và thiết kế cặp mồi có độ dài là 25-26 nu. Dùng cặp mồi này chạy PCR mà chưa lần nào thành công. Bác nào có cao kiến gì giúp mình với?

 

[VET]

Amplify được plasmid rồi, vấn đề là giảm nhiệt độ gắn mồi xuống tới 45oC, hời gian gắn mồi cũng phải dài đến 1 phút và giảm lượng plasmid làm template (khoảng 0,5ng cho 1 reaction 50ul).
Giờ plasmid và gene của mình đều có overlap ở 2 đầu (vì F/R primer của plasmid và R/F primer của gen bổ sung cho nhau mà) không biết PCR có tạo được circle plasmid như là ligation không (làm 2 lần rồi mà chưa được)? Mà nếu được thì plasmid này có bị thay đổi và có biểu hiện gen được hay không (vì mutation is unavoidable).
Anh chị em nào có kinh nghiệm về cái này cùng chia sẻ đi.