Sds-page

[Nguyễn Ngọc Lương]

Các đc xem và chẩn đoán hộ bệnh nhé:

Có thấy mấy cái wells ở giữa, nó bị vồng lên không? Và nhất là dye nó tạo thành vệt trên gel, vệt này khi Western blot nó chạy lên màng luôn (bình thường chả bao giờ dye dính lên màng cả, và cũng không thấy có chuyện dye trên gel mà tẩy (destain) không đi.
Đây là các fractions mình chạy FPLC. Mấy lần trước chạy chung với mẫu thô dialysis nên rất xấu (do các mẫu dialysis chưa hết muối). Các lần gần đây chỉ chạy các fraction có protein of interest thì bị hiện tượng này. Chẳng biết chất gì nữa.
Tất cả các mẫu đều được tủa bằng Acetone trước khi chạy để băng đậm lên chút (mình phải nhuộm bạc vì Commassie không đủ đô). Sau khi tủa Acetone 1 h ở -20 mình đã làm khô bằng SpeedVac trước khi hòa tan lại trong nước (vì sợ có thể lượng muối trong sample đã đủ lớn). Quy trình này đã làm với các mẫu khác không có vấn đề gì.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Protein band sau khi nhuô.m / WB co' thâ'y binh thuong k? Hay la cu~ng vô'ng lên xuô'ng. Thu+o+ng ca'i vu. nay la do sample nhiem cac chat da.ng lipid nen co hoat tinh kieu detergent. Khong phai do muô'i. Thay tu?a Acetone = TCA va ru?a di ru?a la.i nhieu lâ`n co' thê? kha' ho+n.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không giống lipid lắm. Nhưng sẽ thử TCA. Chán quá!
Vẫn đang loại suy dần (mẫu tủa không bị, qua FPLC có fraction bị fraction không).

 

[Cao Xuân Hiếu]

Ba?n gel gi`ma`to?m thê' ba'c cha.y bao nhieu % day?

La.i nhe'. Ba'c tu?a xong hoà nuoc cha.y len binh thuong dung k? The sau do bac chay FPLC elute bang dung dich gi? Co acid qua' hay k? Co tu?a lai fraction k?

Them em bac lay may cai sample da dien di ma thay bâ?n nay tu?a la.i 1 lan roi dien di xem.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Tủa lại fraction bằng acetone đấy. Trước đó thì tủa bằng Ammonium sulfate & dialysis. Chạy Tris-Glycine 12%.
Mẫu tủa ban đầu dialysis chưa hết muối (dialysis 1/500, 1 đến 2 lần thay nước) vì ban đầu chưa biết cách, cứ dialysis trong buffer luôn làm tốn một đống buffer mà muối thì bị loại không hoàn toàn. Sau này cứ dialysis tất trong H2O rồi cuối cùng bổ sung buffer đậm đặc vào thì chạy băng không bị smear/smile/frown nữa. Nhưng mà các fraction này là từ mẫu của những lần trước. Chạy FPLC mới có 3 lần mà bọn nó kêu inh ỏi là tắc cột các thứ (mẫu vẫn filtered đàng hoàng) nên bây giờ tạm stop, do đó không có mẫu mới để thử.
À, mà chả hiểu sao gel lần nào nó cũng tụt xuống và thòi ra 1 tí dưới kính sau khi chạy, làm cái phần rìa dưới nó cứ cong cớn. Ban đầu chạy gel 15% sợ do nặng quá nó tụt, chạy 12% vẫn bị.

 

[cherry]

Tủa lại fraction bằng acetone đấy. Trước đó thì tủa bằng Ammonium sulfate & dialysis. Chạy Tris-Glycine 12%.
Mẫu tủa ban đầu dialysis chưa hết muối (dialysis 1/500, 1 đến 2 lần thay nước) vì ban đầu chưa biết cách, cứ dialysis trong buffer luôn làm tốn một đống buffer mà muối thì bị loại không hoàn toàn. Sau này cứ dialysis tất trong H2O rồi cuối cùng bổ sung buffer đậm đặc vào thì chạy băng không bị smear/smile/frown nữa. Nhưng mà các fraction này là từ mẫu của những lần trước. Chạy FPLC mới có 3 lần mà bọn nó kêu inh ỏi là tắc cột các thứ (mẫu vẫn filtered đàng hoàng) nên bây giờ tạm stop, do đó không có mẫu mới để thử.
À, mà chả hiểu sao gel lần nào nó cũng tụt xuống và thòi ra 1 tí dưới kính sau khi chạy, làm cái phần rìa dưới nó cứ cong cớn. Ban đầu chạy gel 15% sợ do nặng quá nó tụt, chạy 12% vẫn bị.

.
Mau cua ban co do nhot cao nen khi chay FPLC se co pressure cao va may se keu. Ban co the thay dem vai lan bang cot amicon 10000 dalton. Khi dien di gel bi tut la do dieu kien dien di :
- gel cu ( expired) ?
- dien kien chay dien di bi nong , do mA cao? .Ban nen chay dien di trong lanh. Ke ca gel cu expired vai thang neu ban chay trong lanh voi cuong do dong khoang 10 mA per gel se khong bi gel loi xuong va rat dep. Minh doan mau ban co do nhot cao ( co the do detergents X100 ... ? vi the khi dien di cac bang bi nhu vay.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đúng là độ nhớt rất cao. Đây là do môi trường complete medium của nấm men mà. Dialysis 24 tiếng cái màu của nó vẫn không hết. Đi qua cột monoQ một số fraction khá pure vẫn bị có màu.
Mình đã thử dùng cột Amicon (hình như của Milipore phải không?). Không ăn thua. Ly tâm 40 phút mà chỉ có 1 tẹo dịch ở phía dưới.
Gel của mình là gel đổ mỗi lần dùng. Một số đứa nó bảo là do swelling. Mình chạy ở 60 Vol (stacking) và 80 (separating) (đôi khi để 60 cho cả 2 luôn). Khả năng đúng là độ nhớt cao vì ở VN mình chạy constant mA (40) chả có vấn đề, mà bây giờ chạy constant mA 26mA đã bị streaking. Mình đã thử để gel lạnh nhưng nó vẫn cứ tụt. Có lẽ mẫu nhớt quá làm điện trở tăng chăng?
Khổ cái là complete medium thì biểu hiện nó mới khá một chút còn selective medium thì biểu hiện thấp.
Mình đang tính là sẽ giảm nồng độ gel xuống xem sao. Có thể sẽ thử chạy trong đk cold nữa.

 

[cherry]

Đúng là độ nhớt rất cao. Đây là do môi trường complete medium của nấm men mà. Dialysis 24 tiếng cái màu của nó vẫn không hết. Đi qua cột monoQ một số fraction khá pure vẫn bị có màu.
Mình đã thử dùng cột Amicon (hình như của Milipore phải không?). Không ăn thua. Ly tâm 40 phút mà chỉ có 1 tẹo dịch ở phía dưới.
Gel của mình là gel đổ mỗi lần dùng. Một số đứa nó bảo là do swelling. Mình chạy ở 60 Vol (stacking) và 80 (separating) (đôi khi để 60 cho cả 2 luôn). Khả năng đúng là độ nhớt cao vì ở VN mình chạy constant mA (40) chả có vấn đề, mà bây giờ chạy constant mA 26mA đã bị streaking. Mình đã thử để gel lạnh nhưng nó vẫn cứ tụt. Có lẽ mẫu nhớt quá làm điện trở tăng chăng?
Khổ cái là complete medium thì biểu hiện nó mới khá một chút còn selective medium thì biểu hiện thấp.
Mình đang tính là sẽ giảm nồng độ gel xuống xem sao. Có thể sẽ thử chạy trong đk cold nữa.

Rat de xu li mau co do nhot cao. ban dung dem chay cot fa loang mau ra khoang 3 lan sau do dung cot PD 10 de doi dem. Sau khi doi dem ban se nen chay cot Superose 12 hoac sepadex 75 hoac 100 truoc khi chay mono Q. Nhu the mau cua ban se giam han do nhot. Truoc minh tinh sach mau tu Brain chuot cung co lipit rat cao, rat kho chay truc tiep tiep tren Mono Q ( no se tac cot ngay), minh dung open column ( sepadex 75) sau do PD 10 de loai lipit va protein tap khac. Sau do len cot Mono Q hoac S se rat de dang.
Ban chay dong 40 mA cho mot ban gel la cao. No OK khi mau la tinh sach, nhung neu mau tho ban va do nhot cao nen chay dong nho hon khoang 10-15 mA mot ban. Minh chac chan ban se thu duoc ban gel co ket qua dep

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hic. Đk không cho phép chạy thêm cột. Chạy FPLC phải đến chạy nhờ của người ta và bây giờ khả năng đã ảnh hưởng đến cột của người ta rồi nên boss bảo "need 1 more shot for publication" chứ không chạy thử nữa. Do đó từ giờ đến lúc đó hy vọng giải quyết được cái tình trạng của mẫu cũ này rồi sau đó chạy lần cuối để lấy figures thôi.
À, không biết khi dialysis, mình fill hơi đầy tube, có bị ảnh hưởng không nhỉ? Hình như nếu pressure bên trong cao quá thì nước sẽ không vào được và như thế là sẽ không loại được tạp chất à? Mình chỉ không muốn mẫu bị loãng quá khi dialysis thôi.

 

[cherry]

Hic. Đk không cho phép chạy thêm cột. Chạy FPLC phải đến chạy nhờ của người ta và bây giờ khả năng đã ảnh hưởng đến cột của người ta rồi nên boss bảo "need 1 more shot for publication" chứ không chạy thử nữa. Do đó từ giờ đến lúc đó hy vọng giải quyết được cái tình trạng của mẫu cũ này rồi sau đó chạy lần cuối để lấy figures thôi.
À, không biết khi dialysis, mình fill hơi đầy tube, có bị ảnh hưởng không nhỉ? Hình như nếu pressure bên trong cao quá thì nước sẽ không vào được và như thế là sẽ không loại được tạp chất à? Mình chỉ không muốn mẫu bị loãng quá khi dialysis thôi.

Ban dung zeba spin column (product 89882) de loai nhot di
cot chi 0.5 ml va cho load 0.1ml samples thoi. rat tot de loai muoi va do nho truoc khi len cot Mono Q.
Cho cot Mono Q ban co the lam giam pressure bang protocol nay
1. Connect the column inlet to the detector, set the sensitivity to 0.2 AUFS
2. Make sure there is no space between the gel and adaptor, start a reversed flow at a rate of 2-5 ml/min; carry out steps 3-8 in sequence, ensuring each time that the monitored peaks are identical in size before proceeding to the next step
3. Inject 5 ml 2 M NaCl solution, rinse with water or buffer (A).
4. Inject 5 ml 2 M NaOH, rinse with water or buffer (A).
5. Inject 5 ml 2 M NaCl, rinse with water or buffer (A).
6. Inject 5 ml 1 M HCl, rinse with water or buffer (A).
7. Inject 5 ml 75% acetic acide or 1% TFA, rinse with water of buffer (A).
8. Inject 10 ml 2 M NaCl solution or a 2 M solution which has the same counter-ion as the solution used for elution.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Cám ơn bạn Cherry. Hiện tại mình đang focus giải quyết những gì trong phạm vi thôi. Cột MonoQ của lab khác nên không tiện sờ mó. Cột mới, giao cho mình chạy 3 lần thì bị tắc cột phải kêu cty đến sửa nên bây giờ tạm thời để tình hình "nguội" đi tí đã rồi mới dám xin xài lại.
Mình sẽ giải quyết khâu dialysis, nghe nói để loại nhớt có thể hòa loãng mẫu bằng đệm cần dialysis để tăng outward diffusion. Ngoài ra có lẽ phải xử lý tubing trước khi dùng, hy vọng chất gì interfere sẽ bị mất đi.
Mình sẽ chạy gel nồng độ thấp lại và in cold condition.
Nếu mà vẫn bó tay thì đành thắp hương khấn trời phật cho được 1 shot để lấy figure thôi.
Mình may mắn nhất lab là target protein rất basic, chạy 1 phát 1 ra luôn protein sạch, mặc dù nó lại ở flowthrough chứ không phải eluents. Phần lớn protein ngoại bào của yeast đều acidic và high molecular weight. Giờ chỉ giải quyết vấn đề "appearance". Project không quan trọng lắm và cũng chỉ là bước đầu thăm dò nên cứ tạm thế cái đã.
Đang thuyết phục boss lần sau cứ tương 1 cái tag vào làm cho dễ. Có một số loại tag gần đây, ví dụ ELP-intein chả cần affinity column mà chỉ cần 2 lần tủa muối là lấy được protein sạch luôn. Old habits die hard. Boss xem ra vẫn thích kiểu truyền thống không tag.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn Cherry ạ, protein của mình bị nhớt là do glycoprotein hoặc đường chứ không phải do lipid vì mẫu của mình là culture filtrate của nấm men. Bạn gặp trường hợp nào do đường hoặc glycoprotein mà bị vậy chưa? Chán quá. Chạy thử trong đk nhiệt độ thấp rồi mà vẫn bị. Đúng là trong đk nhiệt độ thấp cái gel mình nó không bị swell và thòi ra ngoài nhưng vẫn bị hiện tượng đó. Đành phải gác Western lại.

 

[cherry]

Bạn Cherry ạ, protein của mình bị nhớt là do glycoprotein hoặc đường chứ không phải do lipid vì mẫu của mình là culture filtrate của nấm men. Bạn gặp trường hợp nào do đường hoặc glycoprotein mà bị vậy chưa? Chán quá. Chạy thử trong đk nhiệt độ thấp rồi mà vẫn bị. Đúng là trong đk nhiệt độ thấp cái gel mình nó không bị swell và thòi ra ngoài nhưng vẫn bị hiện tượng đó. Đành phải gác Western lại.

Mình lam qua trinh deglycosydation mau voi N glycosidase . Do can phai co nong do chat tay triton x100 kha cao trong mau nen luc dau chay gel cung bi nhu ban. Nen minh dung cot zeba spin column de thay dem chua mau bang mot dem moi. Chay lai SDS- PAGE len rat dep. Cách doi dem ban bang cot Zebra cung rat don gian vi cot zebra rat nho, moi lan load duoc co 100 Ml mau va chi mat khoang 5- 10 phut la duoc mau mong muon.
1. ban cho 100Ml dem A thich hop cho dien di nao do len cot sau do li tam.( Enzyme cua minh la co pH toi thich o vung acid nen minh thuong dung 0.05 M sodium acetate pH 6.0 cung vai cocktail inhibitors voi nong do thich hop)
2. ban cho 75 Ml mau len cot va bo xung 25 dem thich hop. Sau do li tam thu dich trong la duoc ( trong protocol di kem co chi tiet kha ro). Neu can than hon ban co the rua mau them mot lan nua ).
Ban cung co the tua mau bang 10 % TCA lanh, rua pellet bang Acetone lanh va hoa lai mau bang dem thich hop. Tuy nhien theo kinh nghiem cua minh hieu suat thu hoi protein kha nho neu tua bang 10% cold TCA ma khong co chat mang la 1% BSA.
Ban thu dung cot Zebra column xem , hi vong no co the giup

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Anh Cherry gửi cho em vài column dùng thử được không? (xin lỗi nếu hơi quá đáng).

 

[Nguyễn Duy Hưng]

Nhóm của em làm SDS-page, mẫu là b-galactosidase thì thu đc cái kết quả như thế này (nhuộm bằng Coomassie blue). Ngoại trừ 2 cái land của marker ra thì ko có thấy cái gì đc cả. Mẫu là các fraction của sắc ký, nồng độ vào khoảng 100 - 200 ug/ml, 10 ul mẫu đc load vào mỗi land (1 - 2 ug protein cho 1 land).
Nhóm em chạy 2 cái gel như vậy. Nhóm đang định dùng silver staining với cái gel còn lại vì nghi là hàm lượng protein quá thấp. Có 1 khả năng khác là cái b-galactosidase này nằm ngoài khoảng của marker (MW của nó vào khoảng 116 kD). MW markers mà nhóm sử dụng thì như thế này.

MARKER
MARKER
(Protein Std) ​

MW (daltons) ​

Phiosphorylase B

105,203​

Bovine serum albumin

84,174​

Ovalbumin

50,443​

Carbonic anhydrase

36,811​

Soybean trypsin inhibitor

29,059​

Lysozyme

20,485​

Ko biết là có anh chị nào có kinh nghiệm về vấn đề này chưa. Nhóm cũng ko thể chạy lại gel khác (lab ko cho phép), nếu nhuộm silver mà thất bại thì ko có kết quả để báo cáo luôn.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hạ thấp nồng độ gel xuống thử. 116 coi bộ lớn không lọt qua được lỗ gel 10% đâu. Thử dùng nồng độ thấp hơn xem.

In "Molecular Cloning, A Laboratory Manual " (Sambrook, Fritsch, Maniatis) The effective range of separation of SDS-Gels is

15% = 12-43 kD
10% = 16-68 kD
7.5% = 36-94 kD
5% = 57-212 kD

Hoặc thử gradient gel. 6-20%

 

[Nguyễn Duy Hưng]

Đó cũng là điều em sợ. Vấn đề là gel đc cung cấp bởi staff của trg, họ ko cho mình đổ (resolving gel là 12%, quá cao so với protein của e). Mình chỉ gắn gel vào máy, load mẫu lên, chạy thôi. Tất cả các group khác đều được đưa gel như vậy.
Qua cái kết quả của marker cũng thấy cái thằng 100kDa đi chưa đc bao nhiêu.
Lên argue với ông thầy thì ổng bảo cứ làm đi, hix.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Để cả stacking gel mà nhuộm và đưa cho ông thầy xem làm bằng chứng

 

[Phạm Văn Hậu 2]

Nhóm của em làm SDS-page, mẫu là b-galactosidase thì thu đc cái kết quả như thế này (nhuộm bằng Coomassie blue). Ngoại trừ 2 cái land của marker ra thì ko có thấy cái gì đc cả. Mẫu là các fraction của sắc ký, nồng độ vào khoảng 100 - 200 ug/ml, 10 ul mẫu đc load vào mỗi land (1 - 2 ug protein cho 1 land).
Nhóm em chạy 2 cái gel như vậy. Nhóm đang định dùng silver staining với cái gel còn lại vì nghi là hàm lượng protein quá thấp. Có 1 khả năng khác là cái b-galactosidase này nằm ngoài khoảng của marker (MW của nó vào khoảng 116 kD). MW markers mà nhóm sử dụng thì như thế này.

MARKER
MARKER
(Protein Std) ​

MW (daltons) ​

Phiosphorylase B

105,203​

Bovine serum albumin

84,174​

Ovalbumin

50,443​

Carbonic anhydrase

36,811​

Soybean trypsin inhibitor

29,059​

Lysozyme

20,485​

Ko biết là có anh chị nào có kinh nghiệm về vấn đề này chưa. Nhóm cũng ko thể chạy lại gel khác (lab ko cho phép), nếu nhuộm silver mà thất bại thì ko có kết quả để báo cáo luôn.

Nếu lượng protein bạn cho vào mỗi band là 1-2ug la quá ít vì vậy nhuộm bằng commassie blue sẽ không thấy. Nếu muốn nhuộm bằng commassie blue thì lượng protein nên là 10-20ug. Minh đồng ý với bạn là nhuộm bằng silver stain.

Theo mình, gel 10-12% vẫn thấy được b-galactosidase di vao gel.

Khi nào bạn submit cho thầy?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Ặc ặc. Ai nói 1-2ug mỗi band mà không thấy?
Mình load BSA làm protein chuẩn để định lượng, chỉ load từ 0.5-1 ug là đã thấy băng to đùng rồi.
Silver staining chỉ dành cho những band ở lượng vài đến vài chục nanogram thôi.
Thế theo bạn protein 116 kDal vẫn đi vào được gel 10%-12% tại sao ladder có MW thấp hơn nó đi vào ít thế?