Điện di SDS-PAGE

[Trương Quốc Phong]

Theo kinh nghiem cua toi de co mot ban dien di 1D-gel ?dep can chu y:
1. Chuan bi mau tot : protein phai tan hoan toan, bien tinh hoan toan (dien di bien tinh), nong do cac chat gay nhot phai thap den muc co the,....
2. Do (duc) gel polyacrylamide o nong do thich hop voi protein trong mau cua minh (thong thuong 10 - 12,5% la rat tot doi voi mau la dich chiet tho (crude extract) Dong vat).
3. Chu y den %C trong dung dich acrylamide.
4. Khi do gel chu y den luong APS va TEMED: sau khoang 30 phut bat dau thay su trung hop la duoc
5. Khong nen do ca gel Co (stacking gel) va gel Tach (separating gel) roi de qua dem ma neu muon de qua dem thi chi do Gel tach, khi nao chay thi se do gel Co.
6. Dieu kien chay: Tuy tung doi tuong cu the ma cac ban co the Setup chuong trinh chay khac nhau, tuy nhien thong thuong doi voi 1D gel thi: co dinh mA ( cung co the co dinh Voltage): 1-1.5 mA cho mot gieng dien di. Chu y hieu dien the neu no tang qua 150 V thi phai giam mA xuong. Nen chay o khoang 50 V cho den khi vach mau cua Bromphenol Blue ra khoi gel co, sau do tang len nhu tren.
7. De tranh smearing, va bang protein khong deu nen rua gieng truoc khi Load mau bang cach dung Pipet Halmiton hoac dau tip 100 ul cung duoc.
Thuc te con nhieu dieu luu y khac nhung no khong phai la co ban lam nen toi khong dua ra.
Con cach pha hoa chat thi cac ban co the xem trong cuon Hoefer, day la cuon sach co ban nhat ve dien di protein hoac cuon Electrophoresis in Practice.
( Cac ban co the xem anh dien di cua toi thuong lam voi nhung dieu luu y nay va cho biet the da duoc chua nhe) Cam on.
(Theo nhan xet cua toi thi trong nhung dieu tren dieu quan trong nhat la phai co mau tot)


Ảnh điện di protein trên SDS-PAGE gel 12.5%

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Xin hỏi bạn thường dùng extraction buffer là gì? Theo bạn dùng extraction buffer nào vừa hiệu quả vừa rẻ tiền?
Tôi chỉ có urea, tris, SDS, NaCl, HCl: có làm được extracting cocktail tốt không?
Có người dùng nước cất, PBS, dd NaCl, ddNaOH để làm extracting buffer. Tôi thấy hơi quái vì chẳng thấy lysis reagent chỗ nào? (chẳng lẽ chỉ nghiền mẫu không là đủ) Nhưng kiến thức hơi cạn không phản bác được. Anh em xin cho ý kiến.

 

[Trương Quốc Phong]

Đối với mỗi một đối tượng nghiên cứu, mỗi một mục đích nghiên cứu, và ta sẽ làm gì với mẫu của mình thì sẽ phải dùng các phương pháp khác nhau cũng như chọn các buffer khau.
Ví dụ :
- Bạn muốn tách cytosolic proteins, hay plasma membrane proteins, hay nuclear membrane proteins, .... bạn sẽ phải chọn các đệm khác nhau. Vì sao? vì các tính chất của các proteins ở các vị trí này không hoàn toàn giống nhau.
- Bạn sẽ định làm gì tiếp với mẫu protein thu đựợc? bạn cũng sẽ phải chọn các đệm khác nhau mặc dù bạn đều muốn tách cytosolic proteins. Tại sao như vậy? Tại vì mỗi một phương pháp bạn sử dụng sau đó nó chỉ làm việc trong một điều kiện riêng.Ví dụ bạn dùng mẫu protein để điện di 1D gel khác, 2D gel khac, LC khác, NanoLC khác, PF2D khác,...
Trong nghiên cứu, bạn biết rồi đấy làm sao chọn được phương pháp nào càng đơn giản và càng rẻ tiền càng tốt. Nhưng điều đó không phải lúc nào cũng đúng và không phải trong trường hợp nào cũng áp dụng được. Có những nghiên cứu đòi hỏi bạn phải chấp nhận với những hóa chất đắt tiền.
Trong tay bạn chỉ có urea, tris, SDS, NaCl, HCl bạn vẫn có thể tách chiết đựợc protein nhưng là protein ở đâu trong tế bào (như tôi đã đề cập ở trên) mặc dù bạn không thấy có detergents. Bằng chứng thực tế là trong ảnh mà tôi đã post lên cho các bạn đó, tôi chỉ dùng có mỗi đệm PBS thông thuờng, mà các bạn biết không tôi cũng đã thu được cả protein bám màng đó (Troponin I). Tất nhiên, quy trình tách thì biến đổi đi một chút.
Chúc bạn may mắn.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Nhưng bạn có máy nghiền mẫu (homogenizer) phải không? Nếu nghiền bằng tay mà dùng đệm PBS thì hàm lượng protein thu được rất thấp. Hoặc nếu nghiền mà không có Nitơ lỏng nữa thì càng ít protein.
Mà cái hinh điện di của bạn cho thấy mẫu đã qua tinh sạch rồi, phải không?
Protein nói chung sau khi được sản xuất đều được đóng gói (dù xuất ra ngoài hay giữ lại trong tế bào), do đó nếu không có detergents để lyze màng thì mấy protein thu được chỉ đại diện cho một phần protein nhỏ của tế bào thôi. Vì vậy nếu nói dùng nước cất, dùng đệm NaCl, dùng HCl hoặc NaOH để "chiết" protein thì e không đúng. Mấy cái này chỉ là dung môi hòa tan một số protein thôi.

 

[Nguyễn Phương Thảo]

Nhưng bạn có máy nghiền mẫu (homogenizer) phải không? Nếu nghiền bằng tay mà dùng đệm PBS thì hàm lượng protein thu được rất thấp. Hoặc nếu nghiền mà không có Nitơ lỏng nữa thì càng ít protein.
Mà cái hinh điện di của bạn cho thấy mẫu đã qua tinh sạch rồi, phải không?
Protein nói chung sau khi được sản xuất đều được đóng gói (dù xuất ra ngoài hay giữ lại trong tế bào), do đó nếu không có detergents để lyze màng thì mấy protein thu được chỉ đại diện cho một phần protein nhỏ của tế bào thôi. Vì vậy nếu nói dùng nước cất, dùng đệm NaCl, dùng HCl hoặc NaOH để "chiết" protein thì e không đúng. Mấy cái này chỉ là dung môi hòa tan một số protein thôi.

Có mấy ý bạn nói không chính xác. Tôi có máy nghiền mẫu nhưng vẫn thường chọn cách nghiền bằng tay, hàm lượng protein thu được không phụ thuộc nhiều vào việc này.

Tùy vào trường hợp cụ thể, tuy nhiên nếu tách chiết protein từ suspension cultured cells, tôi thường không sử dụng nitơ lỏng, cũng không thấy có ảnh hưởng gì nhiều đến hàm lượng protein thu được.

Để có chất lượng điện di tương đương với mấy hình do Biochemistry post không nhất thiết phải là mẫu đã qua tinh sạch.

Không có detergents trong extraction buffer vẫn thu được 1 số protein bám màng. Mà nếu có urea và NaCl thì thừa sức thu được cả những protein liên kết chặt với màng ấy chứ.

 

[Trương Quốc Phong]

Như tôi đã nói,
1. Tùy thuộc vào mẫu bạn dùng để tách protein là mẫu gì, thực vật, động vật, vi khuẩn, hay cell lines,... mà bạn sẽ phải chọn phương pháp cho thích hợp. Phương pháp mà tôi muốn nói bao gồm cả quy trình tách chiết và hóa chất mà bạn cần phải dùng.
2. Tùy thuộc vào bạn sẽ định tách proteins gì, nằm ở đâu trong tế bào, hay toàn bộ proteins (total protein) mà bạn cũng cần phải chọn phương pháp thích hợp.
3. Mẫu mà tôi dùng là cả quả tim chuột, tôi quan tâm toàn bộ cytosol protein và một số protein màng (nếu có thể) nên tôi chỉ đùng đệm ?PBS để tách, tuy nhiên để thu được hiệu suất cao tôi dùng kết hợp cả phương pháp Đập cơ học trong điều kiện có Nitơ lỏng (tôi không dùng homogenizer) và siêu âm. Trong ảnh mà tôi đã post, giếng đầu tiên là dịch chiết thô protein, còn các giếng sau đúng là tôi đã xử lý rồi.
Tuy nhiên, không phải mẫu nào cũng cho ảnh điện di rõ ràng (như daffodil đã nói).
4. Nếu là cell lines chẳng hạn, nếu bạn không có Homogenizer, không có Sonicator, bạn chỉ có Nitơ lỏng và các detergent thích hợp bạn hoàn toàn có thể tách được cytosol protein một cách dễ dàng và hiểu quả chỉ bằng phương pháp freeze/thaw. Thậm chí, nếu có Detergent thích hợp bạn cũng không càn gì khác ngoài máy ly tâm. (tất cả những điều tôi nói ở đây là những điều mà tôi đã từng làm rồi)
5. Đối với proteins màng, đây là cả một vấn đề, để tách được protein màng cũng không dễ như daffodil đã nói là chỉ dùng Ure. Vì như chúng ta đã biết, trên màng có rất nhiều loài protein khác nhau với mức độ Kỵ nuớc khác nhau và sự tương tác của nó với protein khác trên màng cũng như các thành phần khác của màng. Do vậy mà chúng ta phải dùng đến các Detergents khác nhau và nồng độ khác nhau.
Vấn là nữa là, chúng ta tách protein nhưng lại có lẫn cả các thành phần protein khác thì điều đó chưa hẳn là mục đích của chúng ta, chúng ta muốn tách riêng thành phần protein màng ra (vì nhiều lý do tôi không muốn trình bày ở đây) lúc đó vấn đề sẽ phức tạp hơn nhiều. Chẳng hạn chúng ta phải làm sao để loại đi các protein tạp nằm bên trong lớp màng, khi lớp màng bị cuộn lại trong quá trình tách chiết (đây là một thực tế). Khi đó ta cần có các hóa chất khác nhau và các buớc thao tác khác nhau để thực hiện điều đó.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Qua thảo luận, tôi được biết biochemistvn có kiến thức khá chắc về thực nghiệm hóa sinh với các kỹ thuật đa dạng. Không biết bạn có thể cùng tham gia xây dựng SHVN bằng cách là moderator của Box Công nghệ enzim - protein được ko? Mong được sự đóng góp tích cực từ bạn.

 

[Nguyễn Phương Thảo]

5. Đối với proteins màng, đây là cả một vấn đề, để tách được protein màng cũng không dễ như daffodil đã nói là chỉ dùng Ure. Vì như chúng ta đã biết, trên màng có rất nhiều loài protein khác nhau với mức độ Kỵ nuớc khác nhau và sự tương tác của nó với protein khác trên màng cũng như các thành phần khác của màng. Do vậy mà chúng ta phải dùng đến các Detergents khác nhau và nồng độ khác nhau.

Tôi chả bao giờ nói là tách protein màng dễ và chỉ cần Urea cả . Tôi chỉ khẳng định lại 1 điều bạn nói ở trên là đôi khi không cần các detergent khác vẫn tách được protein bám màng. Cụ thể là tôi đã từng dùng Urea hay NaCO3 với nồng độ thích hợp để thu được protein màng (prơtein này tương tác chặt với màng) với hiệu quả không khác gì khi dùng Triton X-100.

Ảnh điện di của Biochemistry là silver staining à? Sao crude extract của bạn ít bands thế.

 

[Nguyễn Phương Thảo]

Qua thảo luận, tôi được biết biochemistvn có kiến thức khá chắc về thực nghiệm hóa sinh với các kỹ thuật đa dạng. Không biết bạn có thể cùng tham gia xây dựng SHVN bằng cách là moderator của Box Công nghệ enzim - protein được ko? Mong được sự đóng góp tích cực từ bạn.

Hôm nay rảnh rảnh mới đọc mấy bài trên này, vietbio có phải em H phòng chú Nông không nhỉ?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Hì hì, tỉ tỉ chỉ cần click vào mục thông tin cá nhân là biết rùi. Em nhìn tên chị và Box chị hoạt động chủ yếu là nhận ra từ lâu rùi ) Khi nào rảnh (mà mùa hè qua rồi) ?thì viết review cho em học hỏi thêm nhé.

 

[Trương Quốc Phong]

Qua cách xưng hô của Vietbio cho phép em gọi daffodi là chị nhé.
Chị em mình viết bài trên tinh thần xây dựng, trao đổi kinh nghiệm và kiến thức nhé.
l
1.

Tôi chả bao giờ nói là tách protein màng dễ và chỉ cần Urea cả.

Em không hiểu ý chị viết ở đây là gì:

Không có detergents trong extraction buffer vẫn thu được 1 số protein bám màng. Mà nếu có urea và NaCl thì thừa sức thu được cả những protein liên kết chặt với màng ấy chứ.

Ở đây, Urea là chaotropic agents, chứ không phải là Detergent. Cho nên nếu dùng chỉ Urea không chắc chắn sẽ không tách đựợc protein màng một cách hiệu quả. Cho nên, người ta (em cũng đã dùng) đã phải dùng kết hợp một số chaotropic agents với các Detergents khác thì mới thu đựoc protein màng một cách hiệu quả. Mà vai trò quan trọng ỏ đây là thuộc về Detergent. Vì sao? vì tính chất và cách thức hoạt động của chaotropic agents và detergents (mọi người đều biết rồi ạ).
Ở đây em quan tâm là profile of membrane protein, cho nên cần phải thu được toàn bộ protein màng (nếu có thể). Nếu dùng cách như của chị nói thì cũng có thể vẫn thu được protein màng nhưng chỉ có thể là một vài mà thôi.
Cụ thể: em đã dùng đến cả SB3-10, tất nhiên là cả một số chaotropic agents nữa nhưng theo kết quả phân tích khối phổ em chỉ thu đựợc 1 số protein màng mà thôi. Vì mục đích trong nghiên cứu này không phải là quan tâm đến protein màng nên quy trình tách chiết đã được biến đổi.
Triton X100 (loại khác thì khác) ?không phải là detergent tối ưu cho tách protein màng. Mà amidosulfobetaine với đuôi kỵ nước dài (ASB-14 và SB 3-10 ) mới là detergent được ưa thích (Lab em đang dùng các loại này). Theo em, nếu ai chuẩn bị làm làm về proteins kỵ nước thì nên tham khảo loại detergent này.

2.

Ảnh điện di của Biochemistry là silver staining à? Sao crude extract của bạn ít bands thế.

Đúng ảnh điện di mà em đã post lên là nhuộm bạc. Nó ít băng là đúng thôi thứ nhất là bởi vì mẫu là tim mà; thứ 2, protein mà em quan tâm không phải là low abundant protein. Mức độ abundant của các protein là khác nhau và khác nhau ở các mô khác nhau. Lượng protein em dùng để điện di tương đối ít (tiết kiệm mà). Nên việc nhìn thấy nhiều hay ít chỉ có người làm trực tiếp mới đánh giá chính xác được. Và điều nữa là, ông thầy của em bao giờ ông ấy cũng muốn nhìn original để đánh giá chứ không bao giờ ông ấy nhìn ảnh.

Chị có kinh nghiệm gì thì mách bọn em nhé.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thời đại này để chạy SDS-PAGE thì discontinuous gel được coi là mặc định. Nếu hỏi tại sao thì câu trả lời thường đại khái là để tập trung protein ở đường phân cách để ?chạy"cùng vạch xuất phát". Không thỏa mãn cách giải thích đó tôi tìm được bài viết sau:
Stacking principles:
When glycine from the upper reservoir enters the low pH 6.8 of the stacking gel, it will principally
be in the neutral zwitterionic form, with only a fraction (1%) in the negative glycinate form. This
prevents glycine from being an effective carrier of current. The Cl- ions remain effective current
carriers at pH 6.8 and migrate rapidly toward the anode. During this electrophoresing in the
stacking gel, the Cl- ion concentration becomes depleted at the cathode end of the gel (top), forming
an increasing concentration gradient toward the anode (bottom). The SDS-coated protein molecules
and the dye, which have charge-to-mass ratios greater than that of the glycine but less than that of
Cl-, must now migrate to carry the electrophoresis current behind the Cl- and ahead of the glycine.
As electrophoresis continues, protein molecules reaching the resolving gel will become greatly
retarded, allowing trailing protein molecules to catch up, ensuring that the volume of the protein
sample "presented" to the resolving gel will be much smaller than the volume of the sample initially
loaded onto the stacking gel. This movement of proteins and dye in the stacking gel also creates an
ion gradient, so that eventually the glycine must carry the current behind the proteins. This has the
effect of concentrating (stacking) the proteins in a thin band sandwiched between the Cl- ions and
the glycine molecules at the interface between the stacking and resolving gels. It should be noted
that for the stacking gel to function properly, it must be at the appropriate pH 6,8 where the
glycine counterion is zwitterionic with only slight anionic character.
When the stacked bands enter the higher pH of the resolving gel, glycine becomes anionic, carrying
a higher charge-to-mass ratio than that of the proteins. Now the newly formed glycinate ions move
faster than the proteins, with mobility approaching that of the Cl- ions. A new concentration
gradient forms, requiring that the proteins and tracking dye carry the current in the trail of the Cland
glycinate ions. The proteins move according to their relative mobilities and are separated by
the sieving effect of the resolving gel according to size. The high mobility of the tracking dye
assures that it will migrate faster than the proteins. When the tracking dye reaches the end of the
gel, the electrophoresis is terminated so that the proteins do not run off the end of the gel.
The extract is copied from:
http://www.che.ilstu.edu/jfriesen/CHE343/LabManual/CHE 343 lab manual fall 2005.pdf
Trước tiên để tiện ai cũng theo dõi được tôi lược dịch đoạn trên:
Trước đây khi chạy SDS-PAGE người ta chỉ chạy trên 1 gel là gel tách (resolving gel). Sau này người ta chạy trên gel gép giữa gel dồn (stacking) và gel tách với kinh nghiệm cho thấy chạy trên gel ghép được độ phân giải cao hơn. Có 2 lý do để sử dụng gel ghép:
? ? ? ? ?- cho độ phân giải cao
? ? ? ? ?- lượng protein đi vào gel bằng với lượng protein tải lên giếng (như vậy so sánh giữa thí nghiệm & đối chứng mới chính xác)
? ? ? ? ? Lý giải cho lý do thứ 2 thì bài viết đã nêu rất rõ: gel dồn xốp hơn gel tách nên nó cho tất cả protein chạy thoải mái cho đến khi gặp gel tách thì lớn nhỏ đều chạy chậm lại, tạo điều kiện cho protein lớn bắt kịp protein nhỏ.
? ? ? ? ? Lý do thứ nhất thì bài viết cũng nêu khá rõ mặc dù khó hình dung hơn: ở pH 6.8 Cl- (có trong đệm chạy điện di) tạo nên dòng điện dịch chuyển từ cathode về anode, kéo theo protein phủ SDS theo. Khi cả Cl- và protein chạy về phía đường ranh giới giữa gel dồn và gel tách thì chúng tạo nên gradient ion, làm cho glycine (có trong đệm chạy điện di) vốn là ion có điện tích tổng cộng bằng 0 cũng bắt đầu dịch chuyển về phía anode. Kết quả protein bị kẹp giữa làn Cl- chạy trước và glycine chạy sau, tạo thành một băng rõ rệt ở đường phân cách 2 gel.
? ? ? ? ? Khi băng protein sau khi đã được dồn lại đi vào gel tách thì glycine ở pH 8.8 trở thành anion và có tỉ lệ tích điện:trọng lượng cao hơn protein nên chạy trước protein. Kết quả là glycine & và Cl- tạo nên động lực (gradient ion) để kéo protein về phía anode. Kết quả protein được tách theo kích thước (do điện tích đã bù trừ cho trọng lượng khi tỉ số điện tích:trọng lượng không đổi)
? ? ? ? ? Hy vọng các bạn sinh viên thỏa mãn được théc méc của mình.

 

[talaai0101]

Xin cho mình hỏi tác dụng của của các hóa chất trong kĩ thuật điện di SDS-PAGE này như: Tris, ABE, TEMED, Buffer..... Hiện mình đang cần gấp để kiểm tra. Thân.

 

[alexkorea]

Em chào anh Trương Quốc Phong, em là thành viên mới của diễn đàn. Hiện nay, em cũng đang rất quan tâm đến vấn đề này, vậy anh có thể cho em xin file mềm của cuốn Hoefer và cuốn Electrophoresis in Practice không ạ? Em đang rất cần ạ.
Email của em: letuongk61@gmail.com
Em cảm ơn anh nhiều. Mong nhận được hồi âm của anh.