Cách tìm ra vùng điều khiển Promoter của gen?

[Luyện Quốc Hải]

Xin chào mọi người.
Trong quá trình học, Tôi thường nghe nhắc đến Promoter. Vai trò của Promoter thì ai cũng biết rùi. Nhưng thắc mắc của Tôi là: Làm sao người ta tìm được vị trí chính xác của Promoter trên một gen hoàn toàn mới???? Các cách xác định vị trí Promoter? Hay mở rộng hơn: Khi nghiên cứu một gen hòan toàn mới thì các vấn đề cần nghiên cứu giải quyết là gi??
XIn mọi người mỗi người đóng góp một ý kiến để giải quyết vấn đề trên.

 

[Trần Hoàng Dũng]

DO SHVN bị down nên câu trả lời hơn trễ


PHƯƠNG PHÁP DÒ TÌM PROMOTER VÀ EXON ĐầU 5´

Việc dò tìm đầu 5´ là một trong những thách thức lớn nhất trong việc dò tìm gene do rất khó xác định chính xác promoter và điểm khởi sự phiên mã (transcriptional start site TSS). Hiện nay, xấp xỉ 17.000 gene người xuất hiện trên Genbank chỉ có khỏang 3000 gene là được ghi chú TSS. Hầu hết các cDNA lấy từ mRNA đều bị cắt ngắn đầu 5´ do quá trình phiên mã ngược không thể tạo được đầu 5´. Gần đây, một cơ sở dữ liệu chuyên biệt cho TSS (Database of Transcriptional Start Site DBTSS) đã được phát triển chứa đầu 5´ của khỏang 8000 gene người. Đây thực sự là một nguồn dữ liệu cực kỳ hữu dụng cho nghiên cứu promoter.

Cũng cần nhắc lại là họat động của promoter và quá trình khởi sự phiên mã thực sự khá phức tạp. Sau khi chromatin trong khu vực chứa promoter được tái cấu trúc theo hướng duỗi thẳng và siêu acetyl hóa, phức hợp tiền khởi sự sẽ gắn lên vùng promoter lõi (nằm xấp xỉ 100 bp ở hai phía TSS). Quá trình phiên mã sau đó sẽ được điều khiển chủ yếu bởi các yếu tố phiên mã gắn lên vùng lân cận promoter (khỏang 1 kb theo hướng thượng nguồn của TSS) và vùng intron đầu tiên.

Hiện có nhiều chương trình dùng để chỉ định TSS và và promoter. Nhưng hầu hết đều không có độ chính xác cao, đặc biệt là chúng không có khả năng nhận diện các dấu hiệu dương tính giả. Trong trường hợp người ta có một vùng không gian DNA khá rộng lớn như genome người và việc lập bản đồ trình tự TSS chỉ cần độ phân giải thấp (khỏang xấp xỉ 2kb) đồng thời các TSS này có liên hệ với CpG thì người ta có thể kết hợp hai thuộc tính CpG và promoter (CpG_promoter) cho quá trình dò tìm. Tuy nhiên với những bản độ cần độ phân giải cao (khỏang 100bp) cho TSS thì người ta ưu tiên chọn dấu hiệu promoter và lõi (Core_promote) để tìm kiếm gene.

Chương trình Promoter-Inspector cho thấy nó có thể ước tính tỷ lệ giữa dương tính thật và dương tính giả là 2,3 trong khi chương trình TSSW thì tỷ lệ này là 0,6. Một chương trình khác, Eponine, có tính đặc hiệu và độ nhạy như Promoter Inspector , nó có khả năng chỉ định vị trí TSS bằng cách dò tìm những thuộc tính tinh vi hơn (như là hộp TATA và những đảo CpG gần nhau). Hơn nữa, nó còn gia tăng tính đặc hiệu trong việc dò tìm nhóm gene đồng điều hòa bằng cách khai thác sự tương quan đặc hiệu giữa các điểm gắn yếu tố phiên mã trong một module chức năng.

Cũnng như hầu hết các chương trình chỉ định gene bằng cách dò tìm exon đầu 3´, các chương trình dò tìm gene bằng exon đầu 5´ và promoter cũng có giới hạn tương tự, tức là nó chỉ dò được thực chất cái gọi là vùng mã hóa đầu 5´ (5´CDS).

Gần đây, một thuật tóan cho phép chỉ định đúng exon đầu 5´ đã được công bố đó là FisrtEF (dựa trên QDA- phương pháp phân tích biệt thức bậc hai không tuyến tính- nonlinearal Quadratic Discriminant Analysis). Nó phân tách các exon đầu 5´ có CpG liên quan ra khỏi các exon đầu 5´ không liên quan CpG. Nó có thể chỉ định cả utexon đầu 5´ và cả uexon đầu 5´. Hơn nữa, bằng cách tích hợp nhiều thuộc tính trình tự, nó cho phép tăng độ chính xác khi nhận diện TSS và promoter.

theo Nature Review Genetics, 3 (9), 698-710

 

[Ngô Vũ]

Câu hỏi này rất hay. Một pp cổ điển nhưng vẫn còn được dùng nhiều ngày nay để xác định vị trí promoter của một gene là "promoter bashing", hay tạm dịch là pp bẻ vụn/bẻ nát promoter. Trong pp này, người ta chặt đoạn DNA mà nghi ngờ có vai trò làm promoter từ từ từng đoạn ngắn một rồi nối phía sau những đoạn bị chặt ngắn này một đoạn gene chỉ thị như luciferase. Sau đó người ta so sánh sự biểu hiện của gene chỉ thị giữa các đoạn bị chặt ngắn với toàn bộ đoạn DNA. Tổng hợp những thông tin này sẽ cho biết được đoạn DNA nào có tác dụng làm promoter lớn nhất và đoạn nào hoàn toàn mất khả năng biểu hiện gene chỉ thị thì sẽ tìm ra được vi trí của promoter trên đoạn DNA đó.

Các pp toán học mà lonxon đã trình bày cũng giúp phần nào cho quá trình trên bằng cách so sánh các đoạn DNA có thể là đích kết hợp của các transcription factors với ngân hàng dữ kiện về các đoạn trình tự promoter được khẳng định qua các thực nghiệm đã được làm trước đây. Tuy nhiên, vì người ta vẫn chưa biết nhiều về sự phối hợp của các transcription factor này trên một promoter, cho nên các chương trình tính toán này cũng không có độ chính xác cao. Những chương trình này chỉ trợ giúp quá trình suy đoán và nếu muốn khẳng định thì cuối cùng cũng phải dùng pp thực nghiệm kể trên để chứng minh.

Một pp rất mới ngày nay gọi là ChIP-on-chip, không trực tiếp giúp tìm vị trí promoter, nhưng một trong những kiến thức thu được từ nó sẽ thúc đẩy sự hoàn thiện các chương trình tính toán xác định vị trí promoter và làm cho chúng trở nên chính xác hơn. ChIP-on-chip là pp xác định tất cả các vị trí trên bộ gene mà một transcription factor có thể tương tác. PP này kết hợp pp kết tủa một transcription factor trên một chromatin (chromatin immunoprecipitation-ChIP) và dò tìm đoạn chromatin này trên toàn bộ genome bằng pp microarray (chip).

Còn câu hỏi mở rộng của bạn thì, hì hì, rất rộng. Khi nghiên cứu một gene hoàn toàn mới thì câu hỏi duy nhất là hỏi cái gene này nó làm gì trong tế bào. Tôi sẽ chỉ trả lời tổng quát các cách giải quyết để tìm hiểu vai trò một gene như sau:

1. So sánh trình tự tương đồng với các gene đã được biết vai trò.
2. Coi xem nó được biểu hiện ở đâu: trong nhân, bào tương, trên màng.
3. Những protein mà nó tương tác là gì? ("Hãy kể bạn bè của bạn là ai, tui sẽ kể loại người của bạn là gì")
4. Knockout/knockdown nó rồi coi tế bào/cơ thể có bị sứt mẽ gì không?
5. Giải cấu trúc 3-D của nó

 

[Cao Xuân Hiếu]

Có hướng tiếp cận theo protein là tìm subpopulation của proteome gọi nôm na là DNA specific binding proteins, sau đây khu trú lại cả phía protein và DNA sequence. Như bài review đã chỉ ra, có khá nhiều database cung cấp công cụ tìm promoter (lưu ý đối tượng để chọn database cho đúng) việc làm này ko đem kết quả chính xác, chỉ dùng sử dụng trong phần thảo luận của kết quả, nhưng lại có chức năng định hướng thí nghiệm rất tốt.

Nói chung, hiện giờ làm SHPT ko chỉ giỏi hút pipet mà còn phải biết click chuột đúng chỗ.

Thuật ngữ (bổ sung một số thuật ngữ tương đương để tham khảo)

TSS, điểm khởi đầu phiên mã
chromosome remodelling, tái cấu trúc
acetylation >< deacetylation, siêu acetyl hóa
upstream, thượng nguồn
CpG island, vùng giàu CpG
co-regulated = regulon, gene đồng điều hòa
FisrtEF = First EF = http://www.cshl.edu/OTT/html/first_ef.html

 

[Phạm Xuân Quyền]

trả trả lòi

theo ý kiên của tôi
promotor trong sinh vạt nhân sơ thì là 1 ARN polymeamylase mả hóa cho mọi mARN còn ở sinh vật nhân chuẩn thì do 3 loại ARN polymeamylase
I là arn polymeamylase1sao mã cho các ribosom
II là polymeamylase2 ?sao mã cho cac gen có enxon và intron lớn có quá trình tao ra các arn thông tin sơ cấp phải thành thục đó là promotor của arn poly 2
Trên NST thì số lương gen nhiều do đó chi mới xác định dược vung đinh vị của gen thôi
Chúng ta phải xác đinh chính xác phải dụa vào ARN thông tin và đi ngược lại dò ra vị trí của gen đó
Tuy nhiên cái khó là chúng ta chua tim đựoc vị trí của hệ thông điều hòa nên khó
Vùng tăng cuờng hay vùng suy giảm sao mã co thể nằm ỏvij trí bất kì trên gen nên gây ra nhiều khó khăn cho việc xác định này .Tìm ra đuợc các promotor ta sẻ co cách điều hòa hoat đông của gen

 

[Vũ Thị Quỳnh Chi]

Anh Dũng có thể cho em xin bài báo gốc được không?

 

[Vũ Phi Yên]

Hơn nữa cùng 1 gene có thể có nhiều TSS khác nhau, vị trí có thể cách nhau khá xa, tương cứng với các version ARNm khác nhau trong các loại mô khác nhau. Để xác định TSS trong loại mô cần nghiên cứu tôi thường dùng RACE - PCR. Ngoài promoter còn các đoạn điều hòa ở xa (thông qua position effect), nên phương pháp "promoter bashing" mà bạn Ngô Vũ chỉ có thể giúp phát hiện luôn một enhancer ở xa chẳng hạn.