Xin ý kiến các anh chị

[Thành viên cũ]

Chào tất cả các anh chị, em đang gặp một số khó khăn trong công việc nên em muốn xin ý kiến và giải pháp từ các anh chị.

Hiện em đang học và làm về proteomic analysis, đối tượng em làm là chủng vi khuẩn cổ Thermococus profundus sinh trưởng ở nhiệt độ 80 oC, cụ thể công việc như sau.

Chủng vi khuẩn Thermococus profundus nuôi ở 80oC đến cuối pha Log thì bắt đầu shock nhiệt 30 phút ở 90oC, sau đó phá tế bào bằng sonication và ly tâm siêu tốc để loại bỏ debris và protein màng, protein nội bào được kết tủa bằng 10% TCA và 10% Axeton sau đó chạy điện di 2 chiều để so sánh sự biến đổi của protein trong quá trình heat shock, xác định các spots new, increase, decrease và cắt các spot này, tiếp theo sử dụng MALDI-TOF method để xác định protein, đến giai đoạn này thì em gặp một số khó khăn như sau:

- Chủng Thermococus profundus chưa có full sequence of protein, cho nên không thể confirm chính xác tên của protein đó.
- Đã sử dụng MSMS để giai trình tự một số spot nhưng cũng không thể search được trên internet.
- Không thể sử dụng antibody cho protein của vi khuẩn, như vậy không thể sử dụng Western Blot để confirm được (trừ trường hợp tự tạo được antibody).
- Liệu có sử dụng PCR để confỉm được không?
- Giải pháp tiếp theo cho vấn đề này?

Xin các anh chị cho em ý kiến và giải pháp, hiện giờ em không còn nhiều thời gian, em chỉ còn tối đa là 7 tháng nữa, mong các anh chị giúp với

 

[Trần Hoàng Dũng]

ngu ý của tui trong trường hợp này:

Do chủng bạn làm chưa có ai làm, thế thì sướng quá, bạn được phép đặt tên mới cho new spots và đưa vào ngân hàng dữ liệu protein chứ sao nữa. Sao cứ rụt rè đợi chờ người ta làm sẵn để so sánh mà kô dám mạnh dạn công bố cái mình mới tìm ra?

 

[SHMT]

Lonxon nói phải lắm, nhưng hãy chắc là chưa có ai đặt tên cho protein của Thermococus profundus .
đưa vào ngân hàng dữ liệu cũng không phải dễ đâu, nhưng nếu Bantay làm được thì đó là cái rất hay đấy. sắp lam tiến si đến nơi rồi.hihihih chúc mừng nhé.

 

[Ngô Vũ]

Không biết bạn đã thử làm những điều này chưa:

Vì Thermococcus profundus có họ hàng với Pyrococcus furiosus theo cây tiến hóa (xem bài đính kèm) mà P. furiosus thì trình tự gemone đã có, vậy bạn thử blast cái đoạn trình tự bạn có với thằng này xem.

Bạn dùng trang web này http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/Complete.html thì sẽ kiếm được trình tự của P. furiosus. Nếu là tôi thì tôi sẽ blast hết với mấy thằng có tên là Thermococcus và Pyrococcus ở trang này.

Nếu bạn đọc kỹ cây phân loại ở bài đính kèm (nếu có gì không hiểu thì lonxon là expert, hiện đang chủ trì thảo luận về chủ đề này, có thể giúp) mà thấy có nhiều họ hàng khác nữa thì coi xem nếu nó có trình tự trên trang web trên không để giúp bạn blast càng nhiều càng tốt.

Một cách khác là trên trang blast của NCBI, chọn chổ organism là Archaea.

Kết quả tìm kiếm như thế nào đem lên trên đây để cùng nhau mổ xẻ tiếp.

 

[Thành viên cũ]

Cám ơn các anh chị đã cho ý kiến, theo những thí nghiệm đã tiến hành thì chắc chắn là trình tự genome cũng như protein của Thermococcus profundus không có, số liệu ở đây: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/a.html
không biết anh chị nào có thông tin về Thermococcus kodakaraensis KOD1 không, theo tôi được biết Thermococus sp. có tới 85% DNA sequence giống nhau, vậy có thể dựa vào Thermococcus kodakaraensis KOD1 để thiết kế primer được không?

Tại vì không có protein sequence nên tôi định lấy trình tự của một số protein của Thermococcus profundus đã đọc rồi Blast trên net để lấy full sequence (chắc chắn là sẽ có sự tương đồng) sau đó chuyển ra DNA sequence rồi thiết kế primer, clonning và biểu hiện rồi cuối cùng furify protein đọc lại trình tự để chứng minh.

Theo các anh chị hướng đi này thế nào, các anh chị có hướng đi nào khác nữa không?.

thanks

 

[Cao Xuân Hiếu]

lấy trình tự KOD1 về chuẩn bị ngân hàng Mascot cho -> kết quả được peptide nào thì thử bast xem (PMF). Nếu kết quả MS/MS mà cũng ko blast được thì xem lại pp tiến hành thì nghiệm xem có vấn đề ? chủng thí nghiệm?? Nếu bạn ko thể identify được 1 spot nào thì quả là phải xem lại kỹ thuật.

Nếu chắc mọi việc OK rồi thì dùng microsequencing để đọc trình tự aa từ đầu N -> thiết kế primer câu lại từ cDNA, confirm bằng Northern Blot.