Vấn đề về Primer!

[Vương Văn Sơn]

Theo thông tin và kiến thức mình thu thập được cho đến thời điểm này thì.
Trong học thuyết trung tâm cũng như trong sinh học phân tử thì: đoạn Primer là đoạn RNA ngắn khoảng trên dưới 10 nucleotide.
Vậy cho em hỏi?
Có bắt buộc đoạn mồi phải là RNA không ? có thể là DNA ? và trong trình tự đoạn mồi có Uracil không ?
Và trong SHPT phản ừng PCR cần đoạn mồi: vậy ta sẽ tiến hành thiết kế đoạn mồi như thế nào?
- Bằng phương pháp mò mẳm theo từng thí nghiệm?
- Bằng cách giải trình tự gen của trước rồi thiết kế mồi???
Cám ơn nhiều

 

[Bùi Văn Huy]

Chào bạn
Hiện bây giờ chúng ta phải mua mồi từ nước ngoài, chưa thể pha chế, nếu bạn cần tìm hiểu về PCR thì trên mạng rất nhiều

 

[Ngô Đức Trí]

Hi Văn Sơn,

Theo mình biết định nghĩa về primer của bạn chưa được chính xác đâu.
-A primer is a nucleic acid strand (or related molecule) that serves as a starting point for DNA replication. A primer is required because most DNA polymerases (enzymes that catalyze the replication of DNA) cannot begin synthesizing a new DNA strand from scratch, but can only add to an existing strand of nucleotides.
-A short segment of DNA or RNA that anneals to a single strand of DNA in order to initiate template-directed synthesis and extend a new DNA strand by the enzymatic action of DNA polymerase to produce a duplex-stranded molecule.

Cho nên mình nghĩ chỉ cần xem nó như là 1 oligonucleotide là được.

Còn chuyện thực tế người ta làm thế nào khi thiết kế mồi, theo mình làm là dựa vào trình tự gene mình cần clone. Dựa trên trình tự gene này, bạn có thể dùng phần mềm để hỗ trợ thiết kế được một cặp primer "tốt" hoặc chỉ đơn giản dựa vào kinh nghiệm.

Các thông số khi thiết kế 1 primer tốt bao gồm:
1. length: 17-28bps
2. Hàm lượng G+C từ 60% trở lên
3. 2 đầu primer nên là G hoặc C
4. Tm khoảng 56-80 C
5. Không có cấu trúc kẹp tóc
...

Ngoài ra các thông số khi PCR cũng phải optimize để có thể clone thành công. Làm cái này cũng có may mắn trong đó nữa.

 

[Luyện Quốc Hải]

Trong học thuyết trung tâm cũng như trong sinh học phân tử thì: đoạn Primer là đoạn RNA ngắn khoảng trên dưới 10 nucleotide.

Mình thực sự không biết Học thuyết trung tâm có liên quan gì đến primer (câu hỏi nghiêm túc), ai có tài liệu về học thuyết này ko?

Có bắt buộc đoạn mồi phải là RNA không ? có thể là DNA ? và trong trình tự đoạn mồi có Uracil không ?

Câu này thì chắc bạn đang nhắc đến quá trình sao chép DNA của tế bào. Nhất định DNA polymerase III cần phải có RNA primer (RNA primer được tổng hợp bởi Primase = DNA-directed RNA polymerase) mới tổng hợp được. (Lý do như Trí đã giải thích: do hoạt tính của DNA polymerase chỉ thêm nucleotide vào đầu 3' sẵn có). Sau đó, RNA primer này được loại bỏ bằng DNA polymerase I (nhờ hoạt tính 5'->3' exonuclease) hay ribonuclease H.
Lý do tại sao lại là RNA primer mà không phải là DNA primer: Vì DNA-directed RNA polymerase có thể tổng hợp đoạn mới mà không cần có đoạn mồi nào cả. Và như vậy, đoạn RNA primer đấy CHẮC CHẮN phải có Uracil.
(chú ý: đây là quá trình sao chép DNA trong tế bào, ko phải là trong phản ứng PCR)

Và trong SHPT phản ừng PCR cần đoạn mồi: vậy ta sẽ tiến hành thiết kế đoạn mồi như thế nào?
- Bằng phương pháp mò mẳm theo từng thí nghiệm?
- Bằng cách giải trình tự gen của trước rồi thiết kế mồi???
Cám ơn nhiều

Câu này thì như Trí đã trả lời, có thể tham khảo thêm 2 link sau:
http://www.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htm
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Primer_Design/primer_design.htm

Tuy nhiên cần phải nói rõ thêm 1 vấn đề: Đầu 3' của primer tốt nhất là có 1 vài G or C. Vì DNA polymerase hoạt động tốt khi có đầu 3' ổn định (GC có 3 liên kết H) (điểm bám vào của enzyme). Ngược lại, đầu 5' không nhất thiết phải có G or C (có cũng được, chẳng sao cả), vì thực tế khi thiết kế mồi, người ta có thể gắn thêm các đoạn linker là các điểm cắt RE loe ngoe bên ngòai cũng có sao đâu.

BYE

 

[Vương Văn Sơn]

Cam on

Cam on su chi bao nhiet tinh cua cac ban!
Minh dang rat quan tam dang van de sinh hoc phan tu? Cac ban nao co gi kho hieu hay biet nhung diem quan trong hay mac sai lam trong nghien cuu SHPT hay gui len cho minh cung hoc hoi va tim hieu nhe?

 

[Ho Huu Tho]

Tuy nhiên cần phải nói rõ thêm 1 vấn đề: Đầu 3' của primer tốt nhất là có 1 vài G or C. Vì DNA polymerase hoạt động tốt khi có đầu 3' ổn định (GC có 3 liên kết H) (điểm bám vào của enzyme). Ngược lại, đầu 5' không nhất thiết phải có G or C (có cũng được, chẳng sao cả), vì thực tế khi thiết kế mồi, người ta có thể gắn thêm các đoạn linker là các điểm cắt RE loe ngoe bên ngòai cũng có sao đâu.

BYE

Mình lăn tăn cái chỗ in đậm quá, không biết có quan trọng về điều đó không nhỉ?