Chọn lọc khuẩn lạc dương tính trong tách dòng phân tử

[thuyhanghnue]

Em chào các anh chị , em tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa phytase 1,3kb nhưng đến bước tuyển chon khuẩn lạc dương tính thì gặp vấn đề ạ. Em đã thu được nhiều khuẩn lạc và PCR tuyển chon trực tiếp từ khuẩn lạc thì thu được nhiều khuẩn lạc dương tính nhưng khi em đem nuôi những khuẩn lạc + này để tách plasmid thì em lại không thu được plasmid ạ. Em muốn hỏi các anh chị là tại sao lại không thu được plasmid từ khuẩn lạc dương tính và lỗi là ở khâu nào ạ, ac nào có hướng giải quyết cũng như kinh nghiệm thì chia sẻ em với ạ. Em cảm ơn rất nhiều

 

[Nguyễn Thy Ngọc]

1. Tách plasmid có vấn đề.
2. Thực sự các khuẩn lạc dương tính như bạn nói không mang gen. PCR-colony dương tính giả do bị nhiễm..

Bạn có thể vui lòng mô tả cụ thể từng bước làm của bạn ntn không (tạo dòng, tuyển chọn khuẩn lạc, tách plasmid...) cùng ảnh các kết quả điện di, khuẩn lạc, sơ đồ plasmid. Như vậy các anh chị trong diễn đàn có thể giúp bạn!

Good luck!

 

[thuyhanghnue]

1. Tách plasmid có vấn đề.
2. Thực sự các khuẩn lạc dương tính như bạn nói không mang gen. PCR-colony dương tính giả do bị nhiễm..

Bạn có thể vui lòng mô tả cụ thể từng bước làm của bạn ntn không (tạo dòng, tuyển chọn khuẩn lạc, tách plasmid...) cùng ảnh các kết quả điện di, khuẩn lạc, sơ đồ plasmid. Như vậy các anh chị trong diễn đàn có thể giúp bạn!

Good luck!

Dạ em cảm ơn chị ạ. em xin mô tả các bước:
-đầu tiên em nhân gen thì thì thu được kết quả khá đặc hiệu sau đó e tinh sạch
-tiếp theo em lai đoạn gen vào trong vertor theo tỉ lệ 1:2 ; 1:3 và 1:5 thì kết quả 1:3 cho nhiều khuẩn lạc dương tính nhất. Còn về TB khả biến dh5anpha thì em đã kiểm tra không bị nhiễm cũng như cho tần số biến nạp khá cao
-sau khi thu được các khuẩn lạc dương tính em tiến hành PCR tuyển chọn trực tiếp từ khuẩn lạc thì thi được có khuẩn lạc dương tính. Băng điện di trùng với đôi chứng dương
- sau đó em nuôi các khuẩn lạc dương tính (đã kiểm tra bằng PCR) để tách plasmit thì đến bước này em lại không thu được gì. chỉ có một vạch rất mờ giống như là genome. còn đối chứng dương em cũng tách cùng thì vẫn thu dược kết quả như bình thường nên em nghĩ thao tác làm cũng như KIT tách plasmit của em là không có vấn đề gi
Em rất mong nhận được sự giúp đỡ của các anh chị !!!!

 

[cfareast]

Em chào các anh chị , em tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa phytase 1,3kb nhưng đến bước tuyển chon khuẩn lạc dương tính thì gặp vấn đề ạ. Em đã thu được nhiều khuẩn lạc và PCR tuyển chon trực tiếp từ khuẩn lạc thì thu được nhiều khuẩn lạc dương tính nhưng khi em đem nuôi những khuẩn lạc + này để tách plasmid thì em lại không thu được plasmid ạ. Em muốn hỏi các anh chị là tại sao lại không thu được plasmid từ khuẩn lạc dương tính và lỗi là ở khâu nào ạ, ac nào có hướng giải quyết cũng như kinh nghiệm thì chia sẻ em với ạ. Em cảm ơn rất nhiều

Bạn cứ làm lộn các bước tuyển chọn nhỉ? Bạn phải chắc tay nghề các khâu, từ cloning, biến nạp, nuôi cấy, tách plasmid...

Bạn phải chọn khoảng 5-10 clone+, rồi sau tách nhanh plasmid (Nuôi trong eppendorf 1ml cũng được) ... rất đơn giản, hôm sau tách ào cái rồi đi kiểm tra điện di plasmid, cắt enzyme giới hạn... cũng ào cái là xong (cắt 1 h cũng được)... PCR là bước cuối cùng... có cũng được , ko cũng chẳng sao.

Nghe bạn mô tả thì thí nghiệm của bạn có nhiều khâu có vấn đề như tế bào mọc được trên môi trường chọn lọc (bạn có chắc là chọn đúng kháng sinh hay chất dùng screening hay ko?, có đúng nồng độ hay ko?...).

Bạn có tách plasmid chuẩn hay ko?

Các bước thí nghiệm có cẩn thận hay ko?

Nói chung là ít khi có dương tính giả, vì thế bạn cần chọn >5 khuẩn lạc. Nếu tất cả đều PCR được và ko có plasmid, thì tức là kỹ thuật tay nghề SAI.

Trường hợp khác nữa là đoạn chứa ADN của bạn bị tích hợp vào đâu đó trong genome của VK chủ.. nên khuẩn lạc vừa mọc được trên môi trường chọn lọc, vừa PCR dương tính.... Bạn kiểm tra đơn giản là cắt band DNA ra, PCR xem có ra band 1,3kb ko?

Và 1 điều nữa, nếu làm mãi ko được, bạn cần đọc lại sơ đồ Vector kỹ.

 

[thuyhanghnue]

Bạn cứ làm lộn các bước tuyển chọn nhỉ? Bạn phải chắc tay nghề các khâu, từ cloning, biến nạp, nuôi cấy, tách plasmid...

Bạn phải chọn khoảng 5-10 clone+, rồi sau tách nhanh plasmid (Nuôi trong eppendorf 1ml cũng được) ... rất đơn giản, hôm sau tách ào cái rồi đi kiểm tra điện di plasmid, cắt enzyme giới hạn... cũng ào cái là xong (cắt 1 h cũng được)... PCR là bước cuối cùng... có cũng được , ko cũng chẳng sao.

Nghe bạn mô tả thì thí nghiệm của bạn có nhiều khâu có vấn đề như tế bào mọc được trên môi trường chọn lọc (bạn có chắc là chọn đúng kháng sinh hay chất dùng screening hay ko?, có đúng nồng độ hay ko?...).

Bạn có tách plasmid chuẩn hay ko?

Các bước thí nghiệm có cẩn thận hay ko?

Nói chung là ít khi có dương tính giả, vì thế bạn cần chọn >5 khuẩn lạc. Nếu tất cả đều PCR được và ko có plasmid, thì tức là kỹ thuật tay nghề SAI.

Trường hợp khác nữa là đoạn chứa ADN của bạn bị tích hợp vào đâu đó trong genome của VK chủ.. nên khuẩn lạc vừa mọc được trên môi trường chọn lọc, vừa PCR dương tính.... Bạn kiểm tra đơn giản là cắt band DNA ra, PCR xem có ra band 1,3kb ko?

Và 1 điều nữa, nếu làm mãi ko được, bạn cần đọc lại sơ đồ Vector kỹ.

Dạ vag em cảm ơn góp ý của anh ạ em sẽ trao đổi với cô hd ạ.
Thứ nhất về các bước làm em đều đọc rất nhiều tài liệu và làm theo các protocol (trước khi tiến hành các thí nghiệm em đều thông qua sự đồng ý của cô hướng dẫn ạ). Các bước làm của em không phải là lẫn đâu ạ, vì lượng clone+ em thu được là khoảng 40 nên em phải tuyển chọn xem trong số 40kl đó có khuẩn lạc nào cho kết quả dương tính sau em mới chọn 1-2 kl dương tính đi nuôi và tách plasmit. do đk kinh tế nên em không thể thu đc bao nhiêu kl thì tách plasmid bấy nhiêu kl được ạ
- Thứ hai kháng sinh em chon là ampicillin vì gen của em có đoạn kháng amp và cô hd của em trc đây cũng đã làm về gen này nên em nghĩ kháng sinh cũng như chất dùng screnning và nồng độ là không có vấn đề gì nên cô mới để em tiến hành tn ạ
- Thứ 3 về tách plasmid thì mỗi lần làm em đều tách cùng đối chứng dương thì đc vẫn cho kq chỉ có các mẫu của em là ko cho kq. em đã lặp lại 3 lần và kq đều như vậy nên em nghĩ không phải là do em tách plasmid không chuẩn
- Thứ 4 về các bước thí nghiệm thì em làm rất cẩn thận nhưng cũng khá nhanh chứ ko phải chậm ạ (đó là do các bạn và cô em nhận xét ạ hjhj)
Còn về ý kiến của a em thấy cũng rất hay ạ, em sẽ đề xuất với cô xem có giải quyết được vấn đề không ạ. à anh ơi "cắt band DNA ra, PCR xem có ra band 1,3kb ko?" a nói rõ hơn giúp em được không ạ. Em cảm ơn anh rất nhiều (email của em là thuyhanghnue@gmail.com cac ac có thể email trao đổi giúp em hoặc cho em xin số đt để em gọi tđ trực tiếp vì em đang cần gấp lắm ạ. Tháng 10 là em bv rồi mà giờ còn chưa đâu vào đâu nếu tình hình cứ như thế này cô hd em thông báo trước hội đồng là 1 năm sau em mới được bv ạ huhu )

 

[cfareast]

Thứ nhất: ko ai chọn dòng dùng 1-2 clones, càng nhiều càng tốt. Theo tôi thì phải 5-10 clones.
Thứ 2: tách plasmid cũng nhanh và rẻ tiền và chính xác hơn là em làm PCR. Em làm PCR thì sau này cũng lại phải đi tách lại plasmid để cắt kiểm tra.
Thứ 3: Em xem vector dùng kháng sinh gì, chứ ko phải là gen của em. Cô hd của em dùng gen đó, nhưng có thể dùng vector khác.
Thứ 4: cái này quan trọng. Cái clone của em mọc trên ampicilin agar, chưa chắc đã mọc được ở ampicilin liquid media. Vì vậy, có khi clone em chọn trên agar không đúng.

Và còn nhiều thứ nữa...