Southern blot

[jenynguyen]

Em chào tất cả các anh chị trong diễn đàn. Em đang làm Southern blot sử dụng DIG. Thầy giáo em bảo về đầu tiên xdinh nồng độ plasmid -> kích thước -> tính số phiên bản -> pha loãng...
Với nồng độ đó có hiện vạch được không..., với nồng độ bao nhiêu thì biểu hiện trong thể gen của cây?..

ÔI em thực sự không hiểu làm sao từ kích thước lại suy ra được số phiên bản ạ? Em cũng chưa hình dung được công việc mình sẽ phải thực hiện như thế nào. ..
Các anh chị có hướng giải quyết nào thì chia sẻ giúp em đc ko ạ. Em cảm ơn các anh chị rất nhiều

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn muốn biết số phiên bản (bao nhiêu phân tử) từ nồng độ OD thì bạn phải biết kích thước (số Nu) của phân tử đó chứ bạn.

Còn trường hợp làm Southern, khả năng bạn sẽ dùng enzyme cắt bên trong gene để cắt genome. Khi cắt xong và lai lên màng bạn sẽ dùng chuẩn từ plasmid để tính ngược lại số phân tử của gene đích trong genome, và từ lượng genomic DNA đã sử dụng, sau đó bạn sẽ tính ra được số phiên bản gene này đã tích hợp vào genome.

Ví dụ bạn tính được số phiên bản plasmid của bạn. Sau đó bạn tải 2 phân tử, 4 phân tử, 6 phân tử và 8 phân tử plasmid lên gel rồi chạy điện di và blot lên màng. Đồng thời bạn dùng 2 ug genomic DNA để cắt và chạy trên cùng 1 gel. Nếu bạn biết kích thước của genome bạn sẽ suy ra trong 2 ug đó có bao nhiêu bộ gene. Giả dụ là 4 lần.

Bạn chạy xong và so sánh density.
Giả dụ density band của bạn bằng density của 4 phân tử plasmid, như vậy có nghĩa là trong 2 ug genomic DNA của bạn có 4 gene đích. Vì 2 ug chứa 4 lần bộ gene nên suy ra trong 1 bộ gene chứa 1 phiên bản gene của bạn.

Có nhiều cách để xác định số phiên bản gene trong genome, như Southern, Real-time. Thường người ta sẽ so sánh với một internal control, tức một gene nào đó đã biết trước số phiên bản (copy number) trong genome.

 

[jenynguyen]

Bạn muốn biết số phiên bản (bao nhiêu phân tử) từ nồng độ OD thì bạn phải biết kích thước (số Nu) của phân tử đó chứ bạn.

Còn trường hợp làm Southern, khả năng bạn sẽ dùng enzyme cắt bên trong gene để cắt genome. Khi cắt xong và lai lên màng bạn sẽ dùng chuẩn từ plasmid để tính ngược lại số phân tử của gene đích trong genome, và từ lượng genomic DNA đã sử dụng, sau đó bạn sẽ tính ra được số phiên bản gene này đã tích hợp vào genome.

Ví dụ bạn tính được số phiên bản plasmid của bạn. Sau đó bạn tải 2 phân tử, 4 phân tử, 6 phân tử và 8 phân tử plasmid lên gel rồi chạy điện di và blot lên màng. Đồng thời bạn dùng 2 ug genomic DNA để cắt và chạy trên cùng 1 gel. Nếu bạn biết kích thước của genome bạn sẽ suy ra trong 2 ug đó có bao nhiêu bộ gene. Giả dụ là 4 lần.

Bạn chạy xong và so sánh density.
Giả dụ density band của bạn bằng density của 4 phân tử plasmid, như vậy có nghĩa là trong 2 ug genomic DNA của bạn có 4 gene đích. Vì 2 ug chứa 4 lần bộ gene nên suy ra trong 1 bộ gene chứa 1 phiên bản gene của bạn.

Có nhiều cách để xác định số phiên bản gene trong genome, như Southern, Real-time. Thường người ta sẽ so sánh với một internal control, tức một gene nào đó đã biết trước số phiên bản (copy number) trong genome.

Em cảm ơn anh đã nhiệt tình trả lời và định hướng cho em những việc phải làm. Đọc trên diễn đàn em thấy anh có rất nhiều đóng góp hay và hữu ích cho mọi người. Nhân tiện đây em muốn xin anh chút tài liệu về lĩnh vực Southern blot sử dụng DIG. Em xin cảm ơn anh rất nhiều. Email của em hoanguyen_agi@yahoo.com.vn ạ