Tách genomic DNA bị smear?

[anhtrungbio]

Em chào các anh chị,

Tình hình là không hiểu sao dạo gần đây em tách DNA từ nấm Mucor gặp phải hiện tượng mẫu DNA bị smear gần như hoàn toàn (xem hình). Đáng chú ý là thỉnh thoảng có mẫu thu được lại rất đẹp, nhưng phần lớn là bị smear. Em đã thay đệm lysis buffer mới nhưng vẫn không ăn thua.

Phương pháp:
- Nghiền mẫu trong N2 lỏng, ủ lysis buffer + RNase + proteinase K (2mg/ml): 1h, 37 độ C.
- Loại protein bằng phenol, chloroform : isoamylalcohol (24:1) [em làm khoảng 10 lần mới sạch protein].
- Tủa DNA bằng isopropanol. Rửa tủa bằng EtOH 75%.
- Hòa tan DNA bằng H2Odd.

Các bác cho em xin tất cả các nguyên nhân có thể được không ạ?

Xin chân thành cảm ơn!

 

[cfareast]

Em chào các anh chị,

Tình hình là không hiểu sao dạo gần đây em tách DNA từ nấm Mucor gặp phải hiện tượng mẫu DNA bị smear gần như hoàn toàn (xem hình). Đáng chú ý là thỉnh thoảng có mẫu thu được lại rất đẹp, nhưng phần lớn là bị smear. Em đã thay đệm lysis buffer mới nhưng vẫn không ăn thua.

Phương pháp:
- Nghiền mẫu trong N2 lỏng, ủ lysis buffer + RNase + proteinase K: 1h, 37 độ C.
- Loại protein bằng phenol, chloroform : isoamylalcohol (24:1) [em làm khoảng 10 lần mới sạch protein].
- Tủa DNA bằng isopropanol. Rửa tủa bằng EtOH 75%.
- Hòa tan DNA bằng H2Odd.

Các bác cho em xin tất cả các nguyên nhân có thể được không ạ?

Xin chân thành cảm ơn!

Hình như ủ protein K 56 hay 65oC.

 

[truong369]

Anh loại protein tới 10 lần luôn hả. Cứ dùng pipette hút lên hút xuống là genome nó gãy hết rồi. Khi đã phá mẫu rồi thì thao tác nhẹ, hạn chế hút xả bằng pipette.

Anh thử loại protein một lần thoai rồi chạy điện di chung với mẫu loại 10 lần coi xem có sự khác biệt k, nếu có thì biết nguyên nhân từ đâu rồi.

 

[anhtrungbio]

Anh loại protein tới 10 lần luôn hả. Cứ dùng pipette hút lên hút xuống là genome nó gãy hết rồi. Khi đã phá mẫu rồi thì thao tác nhẹ, hạn chế hút xả bằng pipette.

Anh thử loại protein một lần thoai rồi chạy điện di chung với mẫu loại 10 lần coi xem có sự khác biệt k, nếu có thì biết nguyên nhân từ đâu rồi.

Đúng là mình hút không nhẹ lắm => Cái này sẽ rút kinh nghiệm.

Nhưng loại protein ít lần thì bề mặt giữa 2 lớp hỗn hợp vẫn còn tủa protein màu trắng rất nhiều. Nên mình ko thể làm sạch được protein nếu hút dưới 10 lần.

Theo bạn, lớp tủa trắng đó vẫn còn thì có được không?

 

[anhtrungbio]

Hình như ủ protein K 56 hay 65oC.

Hồi trước mình có làm ủ riêng proteinase K ở 56 độ C overnight. Nhưng ở lab này mình đã thử ủ cả RNase và proteinase K ở 37oC thì kết quả vẫn có lúc OK.

Dù sao mình cũng sẽ thử ủ proteinase K ở 56oC xem sao.

Thank bạn

 

[truong369]

Theo bạn, lớp tủa trắng đó vẫn còn thì có được không?

Còn tuỳ vào mục đích tách DNA để làm gì nữa kìa. Anh cứ nói rõ là sau khi tách genome xong a dùng là gì, nếu có ng biết hoặc làm qua rồi sẽ cho a lời khuyên.

 

[anhtrungbio]

Còn tuỳ vào mục đích tách DNA để làm gì nữa kìa. Anh cứ nói rõ là sau khi tách genome xong a dùng là gì, nếu có ng biết hoặc làm qua rồi sẽ cho a lời khuyên.

Tách DNA xong, mình sẽ dùng để chạy PCR và digest bằng restriction enzymes.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn tách ở scale nào đấy? Dùng EP tube hay Falcon tube?
Kinh nghiệm của tôi là dùng Falcon tube để tách, và dùng các loại pipette kích cỡ lớn (5ml, 1 ml).
Bạn loại 10 lần mới hết protein là hơi có vấn đề rồi. Bạn không cần phải hút hết toàn bộ dịch nổi (aqueous phase) và như thế bạn sẽ giảm được việc dùng PCI quá nhiều lần.

 

[anhtrungbio]

Bạn tách ở scale nào đấy? Dùng EP tube hay Falcon tube?
Kinh nghiệm của tôi là dùng Falcon tube để tách, và dùng các loại pipette kích cỡ lớn (5ml, 1 ml).
Bạn loại 10 lần mới hết protein là hơi có vấn đề rồi. Bạn không cần phải hút hết toàn bộ dịch nổi (aqueous phase) và như thế bạn sẽ giảm được việc dùng PCI quá nhiều lần.

Vâng, cảm ơn bác đã chỉ giáo: Em đã dùng EP tube và cũng dùng pipette loại 1ml.
Em đã xử lý theo các gợi ý của các anh em trong diễn đàn này và pha lại dung dịch proteinase K (em nghĩ các aliquot cũ bị hỏng), ủ ở 56 độ C, 1h. Sau đó ủ RNase 37oC, 1h. Và tiến hành loại protein chỉ đúng 3 lần.
Kết quả khá ổn: băng đậm nét và ít bị smear.
Cảm ơn mọi người rất nhiều.

 

[anhtrungbio]

Tình hình là em đã tách được như hình em post ở đây.

Số mẫu này được chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm 4 mẫu: Những lane cùng số là cùng 1 mẫu. Nhóm bên trái khoảng 300 mg/mẫu, nhóm bên phải khoảng 150mg/mẫu.

Em nghĩ là mẫu bị smear ít thế này là ổn. Nhưng anh tutor bảo là chưa đủ OK để chạy Southern.
Xin nhờ các anh chị em chỉ giáo!!!