đo mRNA bằng QRT-PCR

Dicati · Mar 26, 2013

Mình đang chuẩn bị làm một số thí nghiệm QRT-PCR cho mRNA để xem mức biểu hiện của một số gene. Bạn nào có kinh nghiệm thì xin chia sẻ nhé. Cơ bản có 2 cách để đo lượng mRNA là absolute và relative. Absolute thì cần dựng standard curve, mình thắc mắc là cái mẫu mình cần đo mình có phải biết (đo) hàm lượng luôn không? Hay không cần biết và sẽ được suy ra từ standard curve? Theo các bạn thì ưu và nhược điểm của cách đo bằng standard curve và cách đo bằng việc so sánh với house keeping gene? Mình đang dùng SYBR Green của Stratagene.

Ho Huu Tho · Mar 27, 2013

Absolute thì cần dựng standard curve, mình thắc mắc là cái mẫu mình cần đo mình có phải biết (đo) hàm lượng luôn không?
Ý của bạn hàm lượng ở đây là gì, mình không hiểu.

Hay không cần biết và sẽ được suy ra từ standard curve?
Standard curve sẽ được dựng từ số liệu của các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ.

Theo các bạn thì ưu và nhược điểm của cách đo bằng standard curve và cách đo bằng việc so sánh với house keeping gene?
Để so sánh biểu hiệu gen ở các mẫu khác nhau thường bạn phải so sánh với house keeping gene. Nếu bạn xác định được số lượng tuyệt đối mức biểu hiện gen thì chưa đủ để so sánh mức biểu hiện gen giữa các mẫu. Bạn cần lấy một yếu tố nào đó ra để làm chuẩn thì mới so sánh được.

Dicati · Mar 27, 2013

Cám ơn bác Thọ nha, ý mình hỏi hàm lượng là nồng độ, mình có cần phải đo và kiểm soát nồng độ RNA của mình cần đo khi tiến hành thí nghiệm không? Hay chỉ cần kiểm soát thể tích của mẫu RNA mình làm thí nghiệm rồi sau đó suy ra nồng độ của mRNA của mẫu bằng cách so với standard curve.
Vì theo mình thấy phương pháp standard curve, là cần dựng một standard curve từ một loạt các nồng độ biết trước rồi sau đó mình nếu mình cũng đo nồng độ cho mẫu cần làm thí hơi thừa, tại vì nếu đã biết được nồng độ của mẫu cần làm rồi thì cứ làm rồi suy ra mRNA luôn, không cần phải dựng standard curve làm gì. Nên mình cũng không rõ ý nghĩa của việc dựng standard curve mấy.

Dicati · Mar 27, 2013

Mới xem lại thấy bị một cái warning vì đặt câu hỏi thực nghiệm mà không đưa dữ liệu cụ thể nên mình viết luôn ra thực tế cho dễ hiểu.
Mình đang thí nghiệm xem mức biểu hiện gene của chuột bằng cách dùng QRT-PCR. Mình đã dựng được một standard curve cho RNA với 4 nồng độ RNA như sau 50 ng, 5 ng, 0.5 ng và 0.005 ng. Mình có một mẫu RNA cần đo, ý mình hỏi là có cần biết (kiểm soát) nồng độ bao nhiêu ng của RNA mẫu này khi tiến hành đo không .Hay chỉ cần kiểm soát cái volume lúc mình đo rồi sau đó suy ra nồng độ bằng cách so với standard curve.

Ho Huu Tho · Mar 28, 2013

Vì theo mình thấy phương pháp standard curve, là cần dựng một standard curve từ một loạt các nồng độ biết trước rồi sau đó mình nếu mình cũng đo nồng độ cho mẫu cần làm thí hơi thừa, tại vì nếu đã biết được nồng độ của mẫu cần làm rồi thì cứ làm rồi suy ra mRNA luôn, không cần phải dựng standard curve làm gì.

Bạn cần tách bạch 2 nồng độ khác nhau:
- nồng độ của RNA tổng số hoặc mRN, tính bằng ng/uL.
- nồng độ của RNA mà bạn đang quan tâm, thông thường tính bằng số copy/uL.
Thí nghiệm qRT-PCR là để đo nồng độ thứ hai hay số copy của RNA bạn quan tâm có trong một đơn vị thể tích.

Nên mình cũng không rõ ý nghĩa của việc dựng standard curve mấy.

Đường chuẩn mà bạn thiết lập thực ra không phải từ các mẫu chuẩn biết trước nồng độ (bạn chỉ biết nồng độ RNA tổng số mà thôi), nên khi sử dụng đường chuẩn này bạn sẽ không thể suy ra được số tuyệt đối nồng độ của mẫu cần đo.

đo mRNA bằng QRT-PCR

Dicati

Senior Member

Ho Huu Tho

Senior Member

Dicati

Senior Member

Dicati

Senior Member

Ho Huu Tho

Senior Member

Similar threads

Facebook

Thống kê diễn đàn