Protein engineering by saturation mutagenesis

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào các anh chị,
Em muốn hỏi về Saturation mutagenesis. em muốn làm tăng ái lực của một protein với ligand của nó bằng cách tạo các đột biến ngẫu nhiên. Protein của em có 2 vùng bám chủ yếu với ligand nên Em muốn tạo đột biến ngẫu nhiên trên 2 vùng đó.
Em đang suy nghĩ về việc thiết kế primer. Vấn đề của em là những gốc amino acid trong 2 vùng đó rất gần nhau nên các codon mã hóa cho các gốc amino acid đó cũng gần nhau. Vậy khi em thiết kế primer với các base NNN ở giữa thì primer sẽ chứa rất nhiều NNN.
Anh chị nào có kinh nghiệm làm về đột biến ngẫu nhiên cho em hỏi khi thiết kế primer có chứa các codon NNN ỡ giua74 thì số codon NNN này có giới hạn không? Em định thiết kế primer có chứa khoảng 24 base N ?ở giữa và 2 bên sẽ chứa khoảng 20 base đối mã với DNA mẫu (template).

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Chào Khôn

Theo tôi, trong trường hợp của bạn nên dùng error-prone PCR để tạo đột biến ngẫu nhiên hơn là làm theo cách bạn liệt kê vì

1. Ái lực của protein với ligand của nó đôi khi không chỉ phụ thuộc vào vị trí bám của pr với ligand. Các vùng bên ngoài cũng có vai trò quan trọng.

2. Chi phí theo cách của bạn sẽ lớn hơn nhiều.

Bạn đã thử nghĩ đền việc dùng bioinformatics để làm demo trước chưa?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Yep, ví dụ như kháng thể chỉ gắn với epitope ở CDR nhưng phần FR cũng đâu quan trọng kém, vì chỉ cần đột biến điểm có khả năng thay đổi cấu trúc của FR thì có CDR tương thích cũng như không.
Chắc chắn bioinformatics sẽ tiết kiệm cho bạn khá nhiều thời gian, tiền bạc và công sức.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Về error prone PCR thì trước đó đã có một anh trong lab làm rồi, nhưng anh đã không thể tạo ra một thư viện đột biến ? ?tốt nên đã thất bại. Em mới nhận cái đề tài này, GS bảo là ổng không thích dùng error prone PCR vì ông nghĩ nó đôi lúc cho kết quả không tốt. Ông GS muốn em nghĩ ra hướng tạo đột biến khác nện em mới nghĩ đến việc thiết kế primer với base NNN
Còn về chuyện dùng bioinformatic để chạy demo trước thì em cũng đang suy nghĩ. Em đang tìm tàil liệu về Rosetta (chương trình giúp dự đoán cấu trúc protein ... từ những dữ liệu mà nó cung cấp ta sẽ chọn được những gốc amino acid nào cần phải thay thế). Anh chị nào biết về Rosetta không xin chỉ giáo em với.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Về error prone PCR thì trước đó đã có một anh trong lab làm rồi, nhưng anh đã không thể tạo ra một thư viện đột biến ? ?tốt nên đã thất bại. Em mới nhận cái đề tài này, GS bảo là ổng không thích dùng error prone PCR vì ông nghĩ nó đôi lúc cho kết quả không tốt.

Cái này cần xem lại. Để có kết quả error prone PCR tốt cũng cần thiết kế cẩn thận để xác định trước mình cần tần số đột biến khoảng bao nhiêu trước khi đưa ra qua trình.

Còn về chuyện dùng bioinformatic để chạy demo trước thì em cũng đang suy nghĩ. Em đang tìm tàil liệu về Rosetta (chương trình giúp dự đoán cấu trúc protein ... từ những dữ liệu mà nó cung cấp ta sẽ chọn được những gốc amino acid nào cần phải thay thế). Anh chị nào biết về Rosetta không xin chỉ giáo em với.

Có nhiều chương trình giúp mô phỏng cấu trúc protein. Nếu lab của bạn không có người chuyên về vấn đề này thì nên tìm đến các free database để mô phỏng trên server của họ, nếu protein của bạn không mới thì có thể dùng cách tiếp cận homology modeling. Sau đó cần có phần mềm để docking với ligand và tính toán các thông số khác.