Thắc mắc về kết quả điện di sản phẩm PCR:

[bienkhongbuon]

mọi người cho em hỏi tại sao sau khi em tách chiết DNA của Bacillus Subtilis xong, em tiến hành PCR cùng với 2 mẫu chứng (+) và (-), sau đó đem đi điện di thì mẫu không thu đc vạch nào,trong khi đó chỉ có chứng (+) có 1 vạch, vậy có ai biết lý do tại sao không ạ? ( em thực hiện 20 mẫu nhưng không có mẫu nào có vạch) em nghĩ hoài mà vẫn chưa hiểu rõ được nên nhờ mọi người giúp đỡ.
P/S: trước khi PCR em đã tiến hành điện di để xác định xem mình có thu đc DNA chính xác hay không, nên em nghĩ không phải do mẫu của em bị hư, bên cạnh đó có chứng (+) và (-) kèm theo nên chắc là quy trình và hóa chất không bị gì cả,hix

 

[orion8x]

Vì chứng + dương tính, nên chắc là primer và quy trình kg có vấn đề...
1. DNA bị phân mảnh trong lúc tách chiết
2. SNP tại đoạn DNA đc designed với primer
3. Ít khả năng hơn, bộ primer và chứng dương đc cung cấp của bạn có vấn đề (đã từng thấy trường hợp này trong cái thesis của con bạn )

 

[bienkhongbuon]

Cảm ơn bạn đã giúp đỡ, nhưng theo mình nghĩ thì:
1/ DNA bị phân mảnh trong lúc tách chiết: điều này k biết có khả năng làm cho kết quả điện di PCR k ra hay không,vì khi điện di DNA template thì đúng là có 1 phần bị phân mảnh, nhưng phần lớn nằm đúng vạch DNA chuẩn, nên kết quả DNA template có thể chấp nhận đc.
P/S: cho em hỏi luôn là nếu DNA bị phân mảnh quá nhiều thì cũng sẽ không PCR đc phải k ạ?

2/SNP tại đoạn DNA đc designed với primer:nếu điều này xảy ra thì có phải là nó giống với trường hợp 3 k nhỉ? (ý là cái chứng (+) có vấn đề ) (em vẫn chưa hiểu rõ lắm chỗ này)

 

[cfareast]

Nói chung có nhiều vấn đề dẫn đến kết quả "lung tung".
1- DNA tách bẩn, lẫn lộn các chất linh tinh
2- Primer không chuẩn
3- PCR conditions không chuẩn

4- Mô tả kết quả của chủ thớt cũng không chuẩn, không đầy đủ. Ví dụ " DNA đối chứng + là của con gì, tách cùng mẻ bacillus hay không" "1 band DNA từ PCR" là band gì? có đúng kích thước không" .... genomicDNA kiểm tra có hay không? RNA nhiều hay không???? vân vân...

Không ai có thể trả lời chính xác lỗi do đâu? Bạn phải khoanh vùng, đảm bảo từng bước thí nghiệm phải chuẩn.

Theo tôi, bạn nên:
- Có phải chủng bạn là bacillus giống với đối chứng + hay ko?
- Tinh sạch DNA, điện di xem lượng thế nào?, lấy cùng nồng độ với đối chứng + làm template
- Dò từng nồng độ template
- chạy điện di phải đẹp, chuẩn...
.....
....
good lucks

 

[orion8x]

Nếu chứng + ra dương tính thì chắc chắn quy trình PCR và các reagents kg có vấn đề. Vấn đề còn lại là nằm ngay DNA và quy trình tách chiết DNA, hoặc cùng lắm là primer/chứng dương.
1. Tất nhiên nếu đoạn DNA template bị phân mảnh thì PCR sẽ kg ra band nào. Tuy nhiên khó mà có trường hợp toàn bộ DNA của bạn bị gãy tại đoạn template, trừ trường hợp dùng RE.
2. DNA của bạn có thể bị degraded nếu để quá lâu, hoặc hình thành secondary structure, kg đủ nồng độ DNA, hoặc lẫn ethanol.
3. Bộ primer và chứng dương của bạn có vấn đề nghĩa là, primer đó kg phải designed cho cái DNA của bạn, SNP cũng là 1 trong những trường hợp.

...khi điện di DNA template thì đúng là có 1 phần bị phân mảnh, nhưng phần lớn nằm đúng vạch DNA chuẩn, nên kết quả DNA template có thể chấp nhận đc.

là sao, DNA lấy ra từ stock sao biết đúng vạch đc, mình tưởng sẽ ra smear hoặc nhìu bands nếu dùng RE chứ!?

 

[cfareast]

DNA bị phân mảnh sẽ chẳng ảnh hưởng đến kết quả PCR, nếu các thao tác đều chuẩn.
Đơn giản, chỉ 1 số DNA bị phân mảnh, số còn lại vẫn làm template được. Hoặc bị phân mảnh, cũng sẽ ko gãy vào cái gen của bạn, nên vẫn PCR được.

Tóm lại do thao tác, do bỏ qua 1 số bước quan trọng nào đó... dẫn đến pcr không được.

 

[orion8x]

Tóm lại do thao tác, do bỏ qua 1 số bước quan trọng nào đó... dẫn đến pcr không được.

Nếu là do thao tác thì làm sao chứng dương ra đc sản phẩm . 1 vài mẫu kg ra sản phẩm thì có thể đổ lỗi cho thao tác, còn cả 20 mẫu đều kg ra sản phẩm thì khó mà nói là do thao tác (trừ khi bạn quá tệ tới nỗi thao tác trên chứng dương riêng, và mẫu riêng :mygod

 

[bienkhongbuon]

cám ơn các bác, đúng là vấn đề nằm ở chỗ chỉ có 1 vài DNA bị phân mảnh, số còn lại vẫn làm template đc, nên vẫn sẽ PCR được.... tuy nhiên nếu nói quy trình cbi k kỹ, thao tác sai thì chứng (+) sao lại ra kết quả chính xác, và chứng (-) không ra kết quả cũng là chính xác.

...DNA của bạn có thể bị degraded nếu để quá lâu, hoặc hình thành secondary structure, kg đủ nồng độ DNA, hoặc lẫn ethanol.

Mình đã làm thử lại 20 mẫu khác với cùng điều kiện hóa chất và thời gian bảo quản DNA tách được từ vi khuẩn Bacillus là 1 tuần như lần đầu, thì lại thu đc kết quả, chỉ có 1 số mẫu k cho kết quả như mong muốn.

....- Có phải chủng bạn là bacillus giống với đối chứng + hay ko?
- Tinh sạch DNA, điện di xem lượng thế nào?, lấy cùng nồng độ với đối chứng + làm template

-chủng của mình lấy là chủng Bacillus, điều này có thể chắc chắn đc.
- sau khi tinh sạch DNA , thì điện di ra kết quả chấp nhận được, và đo OD nằm gần 2.0, do đó DNA ddc xem như khá tinh sạch, và nông độ khi làm thí nghiệm là như nhau so với chứng (+).

vậy sai sót trong lần đầu là đâu?

 

[cfareast]

Đối chứng + là từ đâu? DNA ai tách, có cùng mẻ với 20 mẫu kia ko????
các Strains có thể gene sequence khác nhau chút nên primer ko đặc hiệu...
Nếu tất cả đều làm cùng mẻ, thì chắc chắn DNA khác nhau.

 

[orion8x]

Chứng + dương tính => PCR kg sai
Lần 2 làm thành công => primer + DNA template cũng kg sai

Dzị thì mình chỉ có thể nghĩ đc ra rằng DNA có lẫn ethanol hoặc inhibitor trong lúc chiết tách DNA thôi., còn cụ thể lẫn cái gì thì mình kg biết bạn dùng kit gì nên kg biết đc

 

[cfareast]

Mình đã làm thử lại 20 mẫu khác với cùng điều kiện hóa chất và thời gian bảo quản DNA tách được từ vi khuẩn Bacillus là 1 tuần như lần đầu, thì lại thu đc kết quả, chỉ có 1 số mẫu k cho kết quả như mong muốn.

-chủng của mình lấy là chủng Bacillus, điều này có thể chắc chắn đc.
- sau khi tinh sạch DNA , thì điện di ra kết quả chấp nhận được, và đo OD nằm gần 2.0, do đó DNA ddc xem như khá tinh sạch, và nông độ khi làm thí nghiệm là như nhau so với chứng (+).

vậy sai sót trong lần đầu là đâu?

Nếu các chủng bạn phân lập được, hay xin được chủng hoang dại ở VN, tôi chẳng tin nó là bacillus subtilis, và cũng chẳng có cơ sở khoa học, vì để biết nó chính xác con gì, phải làm rất mất công sức, thời gian và money và ở điều kiện việt nam rất khó làm đến loài vi khuẩn.

Trừ khi mua ở ATTC hoặc đã làm rất sâu, có công trình quốc tế về nó...