Các cách làm hạn chế protein biệu hiện ở inclusion bodies

[Phí Quyết Tiến]

Cám ơn các bài viết về vấn đề của bạn Khôn. Nhân tiện topic này tôi cũng có vấn đề biểu hiện fusion protein nên xin hỏi các anh chị có kinh nghiệm:

Tôi biểu hiện protein bằng ?E. coli BL21 dùng expression vector pGEX, protein thu được sẽ dưới dạng GST-protein. Hiện nay protein thu được dưới dạng inclusion body (kiểm tra trên SDS-PAGE), vì vậy ko thể tinh sạch được bằng GST purification module kit.

Tôi đã thay đổi một số điều kiện nuôi cấy để biểu hiện trên chủng BL21 theo những gì mình biết.

- Nhiệt độ nuôi cấy khác nhau
- Nồng độ IPTG từ 0.1 - 1.0 mM
- Thời gian induce bằng IPTG (ở OD 600 khác nhau), induce ở nồng độ tế bào từ thấp đến cao (từ 0.4 đến over 1.5)
- Thay đổ tốc độ máy lắc
- Shifting temperature from 37oC to 30oC after induction
- Inducing for a shorter period of time.

Trong tất cả các trường hợp đều thu được fusion protein dưới dạng inclusion body với size mong muốn với nồng độ protein rất cao (band rất đậm). Để phá vỡ tế bào tôi thêm 1% Triton-X, sau đó frozen tế bào bằng liquid nitrogen rồi lại melt nó ở khoảng 37-40oC, lặp lại khoảng 4 lần thao tác đó. Sau đó mới sonicate rồi ly tâm và check soluble và pellet form. Tôi cũng chưa biết là vấn đề của mình cần giải quyết thế nào.

Tôi muốn được hỏi là trước mắt tôi chưa muốn thay đổi expression vector (vì như thế lại phải order thêm kít tinh sạch protein đi kèm), tôi nên làm gì để thu được dạng solublable protein để có thể tinh sạch được. Theo gợi ý ở trên thì có thế thay đổi chủng E. coli, có ai gợi ý cho tôi cụ thể là nên dùng chủng nào ko, tôi ko có kinh nghiệm nhiều lắm trong lĩnh vực này.

Tôi xin post hình nuôi ở 18oC, ở các nhiệt độ cao hơn, nồng độ Protein thu được còn cao hơn.
Lane: 1, Marker, 2, 3, 4, 5, soluble form và insoluble form (từ pellet) của E. coli BL21 có pGEX và pGEX-xx tương ứng.


Xin cảm ơn sự giúp đỡ của mọi người.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Shifting temperature from 37oC to 30oC after induction

Anh Tiến,
Sao anh không thử giảm nhiệt độ sau khi induce xuống 25 hoặc 20oC. Anh thử giảm nhiệt độ xem,có khi sẽ có quả tốt đó. Hiện giờ em đang nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC trong 18-20h và thấy protein của em biểu hiện tốt.

 

[Phí Quyết Tiến]

Shifting temperature from 37oC to 30oC after induction

Anh Tiến,
Sao anh không thử giảm nhiệt độ sau khi induce xuống 25 hoặc 20oC. Anh thử giảm nhiệt độ xem,có khi sẽ có quả tốt đó. Hiện giờ em đang nuôi cấy ở nhiệt độ 20oC trong 18-20h và thấy protein của em biểu hiện tốt.

Mình đã giảm các kiểu nhiệt độ rồi, kết quả vẫn thế. Cái hình mình post lên là nuôi ở 18oC đấy chứ, vấn đề là nó biểu hiện mạnh quá nên tạo inclusion body, đấy là theo suy đoán cá nhân.

Bây giờ mình cũng chưa biết làm thế nào nữa, ko biết liệu giai đoạn phá tế bào có vấn đề gì ko nhỉ. Khôn biểu hiện bằng chủng E. coli nào thế?











Fix quotation by CXH

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tôi biểu hiện protein bằng  E. coli BL21 dùng expression vector pGEX, protein thu được sẽ dưới dạng GST-protein. Hiện nay protein thu được dưới dạng inclusion body (kiểm tra trên SDS-PAGE), vì vậy ko thể tinh sạch được bằng GST purification module kit.

Trong tất cả các trường hợp đều thu được fusion protein dưới dạng inclusion body với size mong muốn với nồng độ protein rất cao (band rất đậm).

Xin được hỏi protein của anh Tiến muốn biểu hiện có nguồn gốc từ loài nào? prokaryote hay eukaryote?

Tôi muốn được hỏi là trước mắt tôi chưa muốn thay đổi expression vector (vì như thế lại phải order thêm kít tinh sạch protein đi kèm), tôi nên làm gì để thu được dạng solublable protein để có thể tinh sạch được. Theo gợi ý ở trên thì có thế thay đổi chủng E. coli, có ai gợi ý cho tôi cụ thể là nên dùng chủng nào ko, tôi ko có kinh nghiệm nhiều lắm trong lĩnh vực này.

Nếu anh chưa muốn thay cả chủng, cả kit thì thử bỏ 1 ít kháng sinh lúc cấy chuyển sang môi trường cảm ứng. Cái quả này em chưa thử nhưng em nghĩ nếu tìm được cách ức chế sinh trưởng, hoặc giảm hoạt động promoter của vector thì sẽ làm giảm lượng protein tạo ra => dễ tan hơn.

Cách khác đã có những nhóm nghiên cứu tiến hành là họ biến nạp đồng thời protein quan tâm và GroELS của vật chủ vào trong BL21. Như vậy protein sẽ được hỗ trợ folding tốt hơn nhiều. Tất nhiên là hướng này mất thời gian nhưng mà nếu protein của anh thực sự hay thì cũng đáng lắm.

Nếu đổi chủng thì thử với E.coli Rosseta xem.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Để phá vỡ tế bào tôi thêm 1% Triton-X, sau đó frozen tế bào bằng liquid nitrogen rồi lại melt nó ở khoảng 37-40oC, lặp lại khoảng 4 lần thao tác đó. Sau đó mới sonicate rồi ly tâm và check soluble và pellet form.

Anh Tiến,
Tại sao khâu phá vỡ tế bào của anh lại rắc rối vậy?Để phá vỡ tế bào,em chỉ để mẫu trong nước đá và sonicate thôi. Em nghĩ, khi làm việc với protein ở dạng soluble thì cái quan trọng là phải luôn giữ lạnh mẫu.
Em đang dùng chủng Ecoli BL21-DE3 và vector pET

 

[Phí Quyết Tiến]

Xin được hỏi protein của anh Tiến muốn biểu hiện có nguồn gốc từ loài nào? prokaryote hay eukaryote?

Chủng của mình có nguồn gốc từ Prokaryote. Mình chưa có kinh nghiệm gì nên mới gặp rắc rối như thế, có thể vấn đề đơn giản hơn mình nghĩ.

Nếu anh chưa muốn thay cả chủng, cả kit thì thử bỏ 1 ít kháng sinh lúc cấy chuyển sang môi trường cảm ứng. Cái quả này em chưa thử nhưng em nghĩ nếu tìm được cách ức chế sinh trưởng, hoặc giảm hoạt động promoter của vector thì sẽ làm giảm lượng protein tạo ra => dễ tan hơn.

Cái này thì mình mình vẫn đang dùng Amp đối với vector pGEX này thôi. Cách này Hiếu gợi ý cũng rất hay và mình cũng nghĩ đến nhưng chưa biết ức chế sinh trưởng kiểu gì, mình sẽ thử xem sao. Tuy nhiên việc ức chế sinh trưởng của chủng chưa chắc đã đồng nghĩa với việc ức chế hoạt động của promoter, vì mình nuôi ở nhiệt độ rất thấp thì chủng phát triển chậm nhưng hàm lượng protein thu được vẫn cao. Vì lab có sẵn kit nên mình mới dùng véctor này, nếu ko ra có lẽ cũng phải đổi vector và kit. Liệu có thể tăng nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ nên dùng theo chỉ dẫn đối với E. coli ko nhỉ.

Nếu đổi chủng thì thử với E.coli Rosseta xem.

Mình cũng đang bắt đầu tiến hành đổi chủng rồi, và sẽ thử thêm chủng E. coli này xem sao. Thực ra protein của mình cũng ko phải là quan trọng quá, chẳng qua mình muốn confirm cái sequence mình định đưa lên NCBI mã hóa một protein có hoạt tính và molecular weight đúng như tính toán thôi.

Nếu đưa vào thêm chaperone thì rắc rối quá, lại phải thêm một bước nữa, hihi.

Nếu có kết quả mình sẽ thông báo ngay. Hy vọng sẽ tốt.

Tại sao khâu phá vỡ tế bào của anh lại rắc rối vậy?Để phá vỡ tế bào,em chỉ để mẫu trong nước đá và sonicate thôi. Em nghĩ, khi làm việc với protein ở dạng soluble thì cái quan trọng là phải luôn giữ lạnh mẫu.
Em đang dùng chủng Ecoli BL21-DE3 và vector pET

Việc phá vỡ tế bào thì giống nhau thôi, theo kinh nghiệm của mấy đứa trong lab mình thì nó bảo thế hiệu quả hơn nên mình làm theo. Cũng có lúc mình lười và chỉ sonicate thôi thì kết quả vẫn thế. Vấn đề là họ biểu hiện protein được bằng chủng đó, véctor đó mà mình ko làm được, hihi.
Lab mình chưa mua kit để tinh sạch his tag nên mình chưa dùng pET vector, nếu cuối tuần này ko làm ra thì có lẽ mình cũng chuyển sang pET thôi.

Cám ơn mọi người nhiều nhiều, mình sẽ tiếp tục hỏi nhé.

 

[sinhvienhanoi]

nếu bạn dọc kỹ về GST purification sẽ thấy rằng urea or other denaturants that used in disrupting your inclusion bodies will also denature your protein, and the GST tag needs to be folded properly in order to work ( to bind to glutation ligand). His tags are better. Cá nhân tôi đã làm một systematic comparation of two collumn và thấy cũng cố kết luận GST fusion foolowed by inclusion body formation is refoldable and purifyable but much less eficient than chelating column
bạn có thể tham khảo paper này mô tả improvement of nikel column
http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n7/full/nmeth0709-477.html

Khi làm với inclusion body bản không cần thiết phải follow các protocol dai dòng làm gi mà chỉ cần spin down your bacteria and put it dỉectly to 8M urea containg buffer (25oC for atleast 4hrs)rồi, sonify, spin down, collect supernatnt va sử dụng nikel column để tinh chế protein cua ban từ cai lysate này. nó sẽ work out pefect!