Làm cách nào để Design primer cho RT-PCR
- Thread starter paltin
- Start date
Ho Huu Tho
Senior Member
Mồi cho bước tổng hợp cDNA thì có thể sử dụng mồi ngẫu nhiên, mồi poly dT, bên cạnh lựa chọn dùng mồi đặc hiệu. Bước PCR thì Paltin thiết kế primer như một phản ứng PCR bình thường. Quan trọng là bạn biết rõ cần phải khuếch đại vùng nào của gen quan tâm và mục đích là gì.
paltin
Senior Member
Thank nhiều,
Bạn nào có thể chỉ giúp mình làm cách nào để coi được trình tự của 1 gen (caspase-3) ở 1 loại tế bào cụ thể (SW1353 cells), từ đó có thể thiết kế mồi dựa vào phần mềm, sau đó mình sẽ gửi đi cho 1 công ty và họ sẽ tạo mồi đó chi mình để chạy RT-PCR.
Xin cảm ơn
eragon_nhoc
Junior Member
tran van giang
Senior Member
1. Muốn thiết kế mồi cho RTPCR, thì tức là bạn khuêch đại từ cDNA, do vậy nếu bạn nghiên cứu ARN sens thì bạn dựa trên mạch 5'-3' của gen đó và thiết kế 2 mồi, R và F.
2. Nếu bạn tạo RT hay cDNA bằng mồi ngẫu nhiên Random Primer, thì sau đó bạn khuêchs đại với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế,
3. Nếu bạn tạo RT hay cDNA với mồi đặc hiệu antisen (R) (nếu nghiên cứu ARN sens) và với mồi sens (F) (nếu nghiên cứu ARN antisens) thì sau đó bạn khuêchs đại với cặp mồi vừa thiết kế, cho sản phẩm đặc hiệu hơn,
4. Bạn mới làm lần đầu, nên tạo RT bằng mồi ngẫu nhiên, sau đó khuêchs đại thử.
2. Nếu bạn tạo RT hay cDNA bằng mồi ngẫu nhiên Random Primer, thì sau đó bạn khuêchs đại với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế,
3. Nếu bạn tạo RT hay cDNA với mồi đặc hiệu antisen (R) (nếu nghiên cứu ARN sens) và với mồi sens (F) (nếu nghiên cứu ARN antisens) thì sau đó bạn khuêchs đại với cặp mồi vừa thiết kế, cho sản phẩm đặc hiệu hơn,
4. Bạn mới làm lần đầu, nên tạo RT bằng mồi ngẫu nhiên, sau đó khuêchs đại thử.
hoang van duong1
Junior Member
Theo mình thì trước tiên bạn lên NCBI tìm trình tự gen mong muốn của loài quan tâm
có trình tự gen rồi thì bạn có thể dùng các phần mềm thiết kế primer có sẵn trên mạng như http://frodo.wi.mit.edu/ để thiết kế mồi đặc hiệu
Còn giai đoạn tạo cDNA nên dùng mồi poly T
Thông thường mồi đặc hiệu cho môt gen nào đó thường đã được các tác giả nước ngoài thiết kế sẵn, bạn cũng có thể tham khảo thêm từ những nguồn này.
có trình tự gen rồi thì bạn có thể dùng các phần mềm thiết kế primer có sẵn trên mạng như http://frodo.wi.mit.edu/ để thiết kế mồi đặc hiệu
Còn giai đoạn tạo cDNA nên dùng mồi poly T
Thông thường mồi đặc hiệu cho môt gen nào đó thường đã được các tác giả nước ngoài thiết kế sẵn, bạn cũng có thể tham khảo thêm từ những nguồn này.
paltin
Senior Member
Cảm ơn mọi người.
Cho mình hỏi khi minh cDNA minh làm như sau
lấy 1ul RNA đã được tách + 19ul DW vào Maxime RT Premix tube
Chạy với thông số như sau
45 0C--1h
95 0C--5min
sau đó đem 1ul sản phẩm đi PCR
Nhưng khi phát hiện DNA trên agarose thì không thấy band mẫu, nhưng lại thấy mẫu giả (mình biết đó là mẫu giả vì kích thước của no không đúng: đoạn DNA của minh là khoảng 200bp nhưng band xuất hiện lại khoảng 80bp)
AC nào giải thich giùm em với
Thank
Cho mình hỏi khi minh cDNA minh làm như sau
lấy 1ul RNA đã được tách + 19ul DW vào Maxime RT Premix tube
Chạy với thông số như sau
45 0C--1h
95 0C--5min
sau đó đem 1ul sản phẩm đi PCR
Nhưng khi phát hiện DNA trên agarose thì không thấy band mẫu, nhưng lại thấy mẫu giả (mình biết đó là mẫu giả vì kích thước của no không đúng: đoạn DNA của minh là khoảng 200bp nhưng band xuất hiện lại khoảng 80bp)
AC nào giải thich giùm em với
Thank
Ho Huu Tho
Senior Member
Sản phẩm có kích thước 80 bp có thể sản phẩm không đặc hiệu, mà nhiều khả năng là dimer, paltin ạ. Thử tối ưu nhiệt độ gắn mồi của PCR xem.
meodungmeo
Junior Member
Nguyên nhân không ra được thì chỉ có kiểm tra thao tác từng bước và kiểm tra hóa chất. Thầy mình bảo nhiều khi thao tác chỉ chệch đi một chút PCR đã không ra rồi, vì thế nên làm 2 người song song với nhau ( cùng mẫu, hóa chất và các bước y hệt nhau)
