Vấn đề ly tâm, buffer trong các thí nghiệm SHPT

[Cao Xuân Hiếu]

@ Trung: Đồng ý là 8000 vòng/phút trong 5 phút đủ để lắng cặn hầu hết các vi khuẩn và cả bào tử, nhưng li tâm rửa vài lần cũng có thể mất vi khuẩn lúc đổ/hút bỏ dịch nổi.

xin hỏi anh Đức hay bạn nào đã làm protoplast của vk thì ly tâm 8000 rpm (hoặc khoảng 8000xg) có đủ làm vỡ mất protoplast không?

Gợi ý: cho thêm EDTA vào đệm li giải (0.5-1 mM). EDTA bắt các ion kim loại này rất tốt.

Có nên cho EDTA vào đệm rửa không? ví dụ dùng TE buffer thay PBS ?

 

[Lê Hồng Đức]

@ Trung: Đồng ý là 8000 vòng/phút trong 5 phút đủ để lắng cặn hầu hết các vi khuẩn và cả bào tử, nhưng li tâm rửa vài lần cũng có thể mất vi khuẩn lúc đổ/hút bỏ dịch nổi.

xin hỏi anh Đức hay bạn nào đã làm protoplast của vk thì ly tâm 8000 rpm (hoặc khoảng 8000xg) có đủ làm vỡ mất protoplast không?

Protoplast mà li tâm vậy chắc chắn vỡ hết. Tế bào này không có thành (cell wall), giống như các tế bào động vật khác (nếu bạn nào làm nuôi cấy tế bào rồi chắc biết), chỉ chịu được lực li tâm khoảng 1000-3000 vòng/phút là cùng.

Gợi ý: cho thêm EDTA vào đệm li giải (0.5-1 mM). EDTA bắt các ion kim loại này rất tốt.

Có nên cho EDTA vào đệm rửa không? ví dụ dùng TE buffer thay PBS ?

Nên cho EDTA vào cả đệm rửa vi khuẩn nữa!

 

[Cao Xuân Hiếu]

Cảm ơn các câu trả lời của anh. Tôi xin hỏi thêm mấy câu khác về vấn đề liên quan.

1. Tôi biểu hiện 1 recombinant protein trong BL21, cảm ứng IPTG ở OD600=1,0. Sau khi thu cell pellet thì định rửa tế bào bằng 100mM TrisHCl pH7,5. Tuy nhiên khi bỏ buffer này vào thì dù ly tâm tại 8000g 10min, 9000g 5min, rồi lên 12000g 5min cũng ko tạo phase lấy lại supernatant được. Buffer đã hút vào trong dịch nhày của E.coli. Xin hỏi anh lý do tại sao lại vậy? do buffer? do ly tâm? hay yếu tố khác.

2. Trong SHPT thường dùng TrisHCl pH7.5 và pH8.0. Không biết 2 buffer có giá trị pH khác nhau này thường ưa thích dùng cho loại thí nghiệm nào? có hoán vị được cho nhau không?

 

[Lê Hồng Đức]

Cảm ơn các câu trả lời của anh. Tôi xin hỏi thêm mấy câu khác về vấn đề liên quan.

1. Tôi biểu hiện 1 recombinant protein trong BL21, cảm ứng IPTG ở OD600=1,0. Sau khi thu cell pellet thì định rửa tế bào bằng 100mM TrisHCl pH7,5. Tuy nhiên khi bỏ buffer này vào thì dù ly tâm tại 8000g 10min, 9000g 5min, rồi lên 12000g 5min cũng ko tạo phase lấy lại supernatant được. Buffer đã hút vào trong dịch nhày của E.coli. Xin hỏi anh lý do tại sao lại vậy? do buffer? do ly tâm? hay yếu tố khác.

2. Trong SHPT thường dùng TrisHCl pH7.5 và pH8.0. Không biết 2 buffer có giá trị pH khác nhau này thường ưa thích dùng cho loại thí nghiệm nào? có hoán vị được cho nhau không?

1. Xin bạn mô tả kĩ hơn, sau khi li tâm không tạo phase lấy lại supernatant được là thế nào? Tế bào không lắng cặn được à? Bạn thấy sau khi hòa tan cặn tế bào (sau khi gặt khỏi môi trường nuôi cấy) bằng đệm 100mM Tris-HCl pH7.5, bạn có một dịch nhày à? Mong câu trả lời chi tiết từng bước của bạn.
2. Nhìn chung, Tris-HCl pH 7.5 và 8.0 không khác nhau là mấy, trừ một số trường hợp đặc biệt. Chẳng hạn, bạn muốn dùng EDTA thì phải dùng Tris-HCl pH 8.0 vì EDTA dễ tủa ở pH thấp hơn 8. Bạn pha đệm Tris-HCl như thế nào?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Tuy nhiên khi bỏ buffer này vào thì dù ly tâm tại 8000g 10min, 9000g 5min, rồi lên 12000g 5min cũng ko tạo phase lấy lại supernatant được. Buffer đã hút vào trong dịch nhày của E.coli. Xin hỏi anh lý do tại sao lại vậy? do buffer?
Trông có vẻ như bạn đã làm ngược: nếu ly tâm cao quá hoặc lâu quá thì nhầy cũng lắng cùng tế bào luôn? Vậy sao không giảm tốc độ ly tâm/thời gian nhỉ?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Cảm ơn các câu trả lời của anh. Tôi xin hỏi thêm mấy câu khác về vấn đề liên quan.

1. Tôi biểu hiện 1 recombinant protein trong BL21, cảm ứng IPTG ở OD600=1,0. Sau khi thu cell pellet thì định rửa tế bào bằng 100mM TrisHCl pH7,5. Tuy nhiên khi bỏ buffer này vào thì dù ly tâm tại 8000g 10min, 9000g 5min, rồi lên 12000g 5min cũng ko tạo phase lấy lại supernatant được. Buffer đã hút vào trong dịch nhày của E.coli. Xin hỏi anh lý do tại sao lại vậy? do buffer? do ly tâm? hay yếu tố khác.

1. Xin bạn mô tả kĩ hơn, sau khi li tâm không tạo phase lấy lại supernatant được là thế nào? Tế bào không lắng cặn được à? Bạn thấy sau khi hòa tan cặn tế bào (sau khi gặt khỏi môi trường nuôi cấy) bằng đệm 100mM Tris-HCl pH7.5, bạn có một dịch nhày à? Mong câu trả lời chi tiết từng bước của bạn.

Mục đích là để rửa cặn tế bào trước khi phá tế bào thu protein tổng số. Tôi ly tâm lần đầu vào bỏ dịch nổi chứa toàn môi trường đi và thu lấy cell pellet. Tuy nhiên khi cho buffer vào cái cell pellet để ly tâm thì nó không tạo thành phase nước phía trên (supernatant). Tất cả nó là 1 dịch nhầy quánh đồng thể, không lách pipet vào để hút được. Cuối cùng là mất toàn bộ 1ml Tris buffer đó.

Tôi tăng thời gian và tốc độ lên cao hơn để hy vọng cả cell pellet và đống dịch nhày đó tụ lại thành 1 cục để chừa lại cái dung dịch cho tôi hút vứt đi. Nhưng rất tiếc điều đó ko xảy ra. Không hiểu bình thường các anh rửa BL21 bằng cái gì? Các anh đã bao giờ dùng chủng Rosetta chưa?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Mục đích là để rửa cặn tế bào trước khi phá tế bào thu protein tổng số. Tôi ly tâm lần đầu vào bỏ dịch nổi chứa toàn môi trường đi và thu lấy cell pellet. Tuy nhiên khi cho buffer vào cái cell pellet để ly tâm thì nó không tạo thành phase nước phía trên (supernatant). Tất cả nó là 1 dịch nhầy quánh đồng thể, không lách pipet vào để hút được. Cuối cùng là mất toàn bộ 1ml Tris buffer đó.

Cách đơn giản là anh thay bằng nước để rửa.

 

[Lê Hồng Đức]

Mục đích là để rửa cặn tế bào trước khi phá tế bào thu protein tổng số. Tôi ly tâm lần đầu vào bỏ dịch nổi chứa toàn môi trường đi và thu lấy cell pellet. Tuy nhiên khi cho buffer vào cái cell pellet để ly tâm thì nó không tạo thành phase nước phía trên (supernatant). Tất cả nó là 1 dịch nhầy quánh đồng thể, không lách pipet vào để hút được. Cuối cùng là mất toàn bộ 1ml Tris buffer đó.

Tôi tăng thời gian và tốc độ lên cao hơn để hy vọng cả cell pellet và đống dịch nhày đó tụ lại thành 1 cục để chừa lại cái dung dịch cho tôi hút vứt đi. Nhưng rất tiếc điều đó ko xảy ra. Không hiểu bình thường các anh rửa BL21 bằng cái gì? Các anh đã bao giờ dùng chủng Rosetta chưa?

Vậy thì ngay sau khi bạn cho buffer vào, các tế bào của bạn đã bị vỡ rồi. Dịch nhầy quánh đó là do nhiễm sắc thể của vi khuẩn được giải phóng đó. Mình cũng đã nghi ngờ điều này nên mình hỏi bạn pha đệm rửa như thế nào. Bạn không làm gì được thêm khi vi khuẩn đã vỡ đâu. Bạn phải pha lại đệm khác thôi, hoặc như Hưng nói, rửa bằng nước.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

"cell pellet và đống dịch nhày đó tụ lại thành 1 cục để chừa lại cái dung dịch cho tôi hút vứt đi"
Nếu tế bào bị vỡ thì ít nhất bạn Hiếu ly tâm số vòng cao và thời gian lâu như vậy cũng phải có pha lắng và pha nổi chứ? Hay DNA nó lấy mất hết nước rồi? Ngộ thật!
Ngoài ra nếu rửa bằng nước cất (nhược trương hơn cả đệm) tế bào cũng có thể vỡ mà. Phải rửa bằng PBS (giống tế bào đ/v) chứ nhỉ?

 

[Lê Hồng Đức]

"cell pellet và đống dịch nhày đó tụ lại thành 1 cục để chừa lại cái dung dịch cho tôi hút vứt đi"
Nếu tế bào bị vỡ thì ít nhất bạn Hiếu ly tâm số vòng cao và thời gian lâu như vậy cũng phải có pha lắng và pha nổi chứ? Hay DNA nó lấy mất hết nước rồi? Ngộ thật!
Ngoài ra nếu rửa bằng nước cất (nhược trương hơn cả đệm) tế bào cũng có thể vỡ mà. Phải rửa bằng PBS (giống tế bào đ/v) chứ nhỉ?

Ngay cả Hiếu tăng vòng li tâm cũng không để làm gì khi phần lớn (nếu không phải tất cả) tế bào vi khuẩn đã vỡ. Protein giải phóng hết ra ngoài rồi còn đâu. Vả lại, DNA (NST) của vi khuẩn một khi được giải phóng sẽ to hơn vi khuẩn rất nhiều lần và thừa sức chiếm chỗ hết cái 1 ml "đệm Tris" của Hiếu.

Tế bào vi khuẩn có vách tế vào (cell wall) nên không dễ vỡ trong nước cất đâu (tất nhiên nước cất thật, chứ nếu nước cất có chất X gì đó giống trong đệm của Hiếu pha thì mình không đảm bảo vi khuẩn không vỡ đâu nhé ). Rửa vi khuẩn vài lần, tổng cộng vi khuẩn ở trong nước khoảng 15 phút thì OK không sao.

@ Hiếu, có khi nào bạn nhầm Tris và Triton không thế ?:??

 

[Cao Xuân Hiếu]

@ Hiếu, có khi nào bạn nhầm Tris và Triton không thế  :??

Không đâu. Triton là detergent nên khi đảo ngược ống vài lần thì sẽ bọt đầy thôi. Ngoài ra khi pha Triton thì đâu phải chỉnh pH linh tinh làm gì. Nói chung đây là dung dịch TrisCl pH7.5 chính xác, nhưng về cái 100mM thì có vấn đề không?

 

[Lê Hồng Đức]

@ Hiếu, có khi nào bạn nhầm Tris và Triton không thế  :??

Không đâu. Triton là detergent nên khi đảo ngược ống vài lần thì sẽ bọt đầy thôi. Ngoài ra khi pha Triton thì đâu phải chỉnh pH linh tinh làm gì. Nói chung đây là dung dịch TrisCl pH7.5 chính xác, nhưng về cái 100mM thì có vấn đề không?

100 mM Tris-HCl pH 7.5 chính xác thì không thể làm vỡ tế bào vi khuẩn của bạn ngay sau khi hòa cặn được. Khi pha đệm Tris, bạn sẽ có pH rất cao (khoảng 10) nên phải dùng HCl để chỉnh pH xuống (tuy nhiều công ty bán sẵn Tris-HCl, trong trường hợp đó bạn không phải chỉnh pH nhiều lắm).

Mình muốn nhân đây đề cập đến một điểm về pha đệm. Một lỗi quan trọng khi chỉnh pH mà nhiều bạn mắc phải là chỉnh quá tay HCl, sau đó dùng NaOH chính ngược lại (hoặc quá tay NaOH và dùng HCl chỉnh ngược). Đây là một lỗi cơ bản "không thể tha thứ" khi pha đệm, vì cái mà các bạn làm là tạo ra muối NaCl (NaOH + HCl) và phá hỏng hệ đệm. Cái dung dịch các bạn tạo ra, có thể vẫn đúng pH, nhưng không còn khả năng "đệm pH" nữa, tức là nếu gặp phải acid hoặc base, nó không giữ được pH ổn định cho dugn dịch của các bạn.

Trở lại với bạn Hiếu, nếu bạn đảm bảo đệm của bạn chỉ có Tris và HCl thôi, với nồng độ Tris 100 mM và pH đệm là 7.5, ngoài ra không còn chất X gì khác dính trên thành ống đong hay trong cốc pha đệm, và đệm của bạn tương đối mới (không có quần thể sinh vật kì lạ nào trong đó), thì có lẽ cách tốt nhất là rửa tế bào vi khuẩn bằng nước. Chỉ cần một lượng vô cùng nhỏ chất tẩy rửa (chẳng hạn ai đó rửa ống đong bằng xà phòng) còn sót lại cũng đủ làm nên sự khác biệt.

BL21 là chủng E. coli phổ biến để sản xuất protein (Rosetta là gì thì mình chịu). Cũng có thể protein của bạn xuyên màng (hoặc gắn màng) nên vi khuẩn yếu và dễ vỡ. Protein của bạn là gì, có mang trình tự tín hiệu (signal sequence) không? Đây là một vùng protein (thường nằm ở đầu N) kị nước, khoảng 20 aa, có vai trò hướng protein về phía màng để xuất khẩu. Hoặc protein của bạn có nhiều vùng kị nước trong trình tự aa, làm cho protein nằm trong màng tế bào. Bạn có thể kiểm tra trình tự protein của bạn bằng phần mềm Protean trong gói dụng cụ DNASTAR nếu có.

 

[Cao Xuân Hiếu]

100 mM Tris-HCl pH 7.5 chính xác thì không thể làm vỡ tế bào vi khuẩn của bạn ngay sau khi hòa cặn được. Khi pha đệm Tris, bạn sẽ có pH rất cao (khoảng 10) nên phải dùng HCl để chỉnh pH xuống (tuy nhiều công ty bán sẵn Tris-HCl, trong trường hợp đó bạn không phải chỉnh pH nhiều lắm).

Mình muốn nhân đây đề cập đến một điểm về pha đệm. Một lỗi quan trọng khi chỉnh pH mà nhiều bạn mắc phải là chỉnh quá tay HCl, sau đó dùng NaOH chính ngược lại (hoặc quá tay NaOH và dùng HCl chỉnh ngược). Đây là một lỗi cơ bản "không thể tha thứ" khi pha đệm, vì cái mà các bạn làm là tạo ra muối NaCl (NaOH + HCl) và phá hỏng hệ đệm. Cái dung dịch các bạn tạo ra, có thể vẫn đúng pH, nhưng không còn khả năng "đệm pH" nữa, tức là nếu gặp phải acid hoặc base, nó không giữ được pH ổn định cho dugn dịch của các bạn.

Trở lại với bạn Hiếu, nếu bạn đảm bảo đệm của bạn chỉ có Tris và HCl thôi, với nồng độ Tris 100 mM và pH đệm là 7.5, ngoài ra không còn chất X gì khác dính trên thành ống đong hay trong cốc pha đệm, và đệm của bạn tương đối mới (không có quần thể sinh vật kì lạ nào trong đó), thì có lẽ cách tốt nhất là rửa tế bào vi khuẩn bằng nước. Chỉ cần một lượng vô cùng nhỏ chất tẩy rửa (chẳng hạn ai đó rửa ống đong bằng xà phòng) còn sót lại cũng đủ làm nên sự khác biệt.

Nguyên lý pha Tris thì tôi cũng nắm được. Mặc dù, bình Tris đó ko phải đích tay tôi pha mà do KTV chuẩn bị, tuy nhiên tôi tin tưởng vào kinh nghiệm và tinh thần trách nhiệm của nhóm KTV chỗ tôi. Để kiểm tra, tôi có thể kiếm 1 bình Tris khác, cùng với pH khác để làm với đống vk đó xem ntn.

Cũng có thể protein của bạn xuyên màng (hoặc gắn màng) nên vi khuẩn yếu và dễ vỡ. Protein của bạn là gì, có mang trình tự tín hiệu (signal sequence) không? Đây là một vùng protein (thường nằm ở đầu N) kị nước, khoảng 20 aa, có vai trò hướng protein về phía màng để xuất khẩu. Hoặc protein của bạn có nhiều vùng kị nước trong trình tự aa, làm cho protein nằm trong màng tế bào. Bạn có thể kiểm tra trình tự protein của bạn bằng phần mềm Protean trong gói dụng cụ DNASTAR nếu có.

Protein tôi là một protease có SP.