Điện di SDS PAGE protein

[Đặng Trịnh Minh Anh]

Khi em chạy điện di protein thường có những band rất đậm và những band rất mờ (có file kết quả gửi kèm).Hiện tượng đó có phải là do hàm lượng protein thành phần không đều.Các anh chị có cách nào khắc phục hiện tượng đó không.

 

[Dương Văn Cường]

Minh Anh cần nêu cụ thể hơn:

1. Mục đích thí nghiệm của em.
2. Chú thích các lane.
3. Band nào là ban dự kiến.


Anh có làm biểu hiện gene trong E. coli. Mục đích thí nghiệm của anh là xem con E.coli sau khi được chuyển vector chứa gene của anh vào thì nó có khả năng biểu hiện được ra protein mong muốn hay không. Sau khi phá tế bào anh chạy điện di protein tổng số của E.coli. Bình thường không có ai quan tâm đến tất cả các band (vì không thể biết được), chúng đậm nhạt ra sao mặc kệ, chỉ cần xem ở vị trí dự đoán của mình:

1. Có xuất hiện band hay không. Mẫu của mình có band, mẫu đối chứng âm không có band tương ứng là OK rồi.
2. Nếu mẫu của mình xuất hiện mà mẫu đối chứng âm cũng có band thì xem của mình có đậm hơn hay không.


Trên diễn đàn mình có anh Trương Quốc Phong có nhiều kinh nghiệm làm protein, có khó khăn gì em cứ đưa lên nhưng nhớ là phải cụ thể, tin rằng em sẽ nhận được câu trả lời.

 

[Dương Văn Cường]

Một cách rất đơn giản để có bản gel đẹp hơn là sau khi xử lý mẫu xong thì ly tâm mạnh tay một chút vì khi đó các protein bị lắng xuống sẽ nhiều hơn, phần dịch nổi là cái phần mà em hút để điện di sẽ còn lại ít protein hơn. Em có thể thử ở 10000 vòng / 10 phút. Cứ mạnh dạn mà làm, thậm chí tăng lên 12.000 cũng không sao. Nếu có vấn đề thì lôi mẫu ra voltex trở lại, kô sợ mất protein đâu.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Theo như hình của bạn thì vấn đề ko phải tại bước điện di vì các băng vạch phân tách khá tốt. Ở đây là bước cố định, nhuộm và tẩy nhuộm hoặc do kỹ thuật chụp ảnh ko tốt. Bạn miêu tả lại các bước trên may ra có thể giúp đc.

Bước ly tâm mà Cường nói thực ra để loại bỏ tạp chất và các protein ko tan (inclusion body) ra khỏi các soluble proteins (cái mà đã tạo được cấu trúc đúng). Bước đó quyết định độ sạch của mẫu.

 

[Đặng Trịnh Minh Anh]

Cảm ơn anh Cường
Mục đích chạy điện di của em là xác định các protein đặc trưng của virus.
Các giếng từ 1-5 là của ?dịch virus được nhân lên trong tế bào giếng 3 là đối chứng tế bào,giếng 6 là thang chuẩn,giếng 7 là đối chứng của tôm sạch không nhiễm virus, giếng từ 8-10 là dịch chiết từ tôm bị nhiễm virus.
Band dự kiến của em là band 55, 40, 24 kDa
Thang chuẩn có các trọng lượng lần lượt là: 107, 81, 48.7 , 33.8, 27, 20.7 kDa.
Sau khi chạy điện di xong em còn làm Western Blot.Em chạy điện di trước để đánh giá trước rồi sau đó mới làm Western Blot. Nhưng nhìn hình điện di thì không phân biệt được sự khác nhau.Thực sự là dựa trên thang chuẩn thì không thể phân biệt được giữa 55 và 40 kDa.

 

[Dương Văn Cường]

giếng 7 là đối chứng của tôm sạch không nhiễm virus, giếng từ 8-10 là dịch chiết từ tôm bị nhiễm virus

Nhìn ở đây thì anh không thấy sự khác biệt nào đáng kể giữa đối chứng âm với 2 mẫu tôm bị bệnh số 8 và 9. Riêng lane 10 thì có manh mối:

- Có band kích thước khoảng 24 đậm hơn so với đối chứng.
- Xuất hiện band mới với kích thước khoảng 40.

Em đã làm bao nhiêu mẫu rồi? Các anh chị hướng dẫn ở lab đã giải thích chưa?
Em cứ tiến hành Western Blot đi, không nên đợi phải nhìn rõ điện di mới làm WB. Trong nghiên cứu chạy ngược chạy xuôi, cái này hỗ trợ cái kia là chuyện dĩ nhiên. Biết đâu sau khi làm WB em có thể có thê dữ liệu để giải thích hoặc để giải quyết phần điện di. Nếu có kết quả WB rồi thì em đưa lên luôn.

Câu em viết là kô phân biệt được band 40 với 55 là sao anh không hiểu?

Điều nữa là em chốt hạ lại các câu hỏi của em nhé, anh thấy nói loăng quăng 1 hồi mà kô biết có gãi đúng chỗ ngứa của em không. ?

Mục đích chạy điện di của em là xác định các protein đặc trưng của virus.

Có  điểm này anh muốn biết thêm về lý thuyết. Sau khi xâm nhiễm virus sẽ gắn vật chất di truyền vào genome vật chủ và lợi dụng hệ thống di truyền của vật chủ để tổng hợp ra các protein cấu tạo nên vỏ virus. Vấn đề ở chỗ sau khi được tạo ra thì các protein này sẽ kết hợp để hình hành vỏ virus hoàn chỉnh. Vì vậy, tại thời điểm nào thì em có thể thu được từ mẫu tôm bị bệnh những protein của virus chưa kết hợp thành vỏ hoàn chỉnh?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thông thường muốn các băng không đậm nhạt khác nhau nhiều thì chạy protein ít lại, tăng thời gian nhuộm và thời gian rửa lên.

Muốn tách ra nhiều băng nữa thì đệm tải mẫu cần có urea, mercaptoethanol (DTT), SDS và đun nóng đủ thời gian (95 độ trong 10 phút).

Nếu muốn ra các băng thẳng đẹp thì chạy 100 V nhưng các băng sẽ tách nhau kém.

Nếu muốn tách các băng ra tốt chạy ở 60 V

Nếu băng mình quan tâm là băng nhạt quá thì hình như có cách là chạy ?được khoảng 10 phút thì tải thêm mẫu lên giếng (không chắc đâu nghe -chỉ học lóm được bên forum khác thôi) - cứ thử xem sao. Có lẽ biểu hiện bệnh thì chủ yếu là định tính nên có băng xuất hiện là được phải không?

 

[Đặng Trịnh Minh Anh]

Em cam on anh Cường và anh Lương.
Lần chạy điện di tới em sẽ làm theo cách của anh Lương.

Có  điểm này anh muốn biết thêm về lý thuyết. Sau khi xâm nhiễm virus sẽ gắn vật chất di truyền vào genome vật chủ và lợi dụng hệ thống di truyền của vật chủ để tổng hợp ra các protein cấu tạo nên vỏ virus. Vấn đề ở chỗ sau khi được tạo ra thì các protein này sẽ kết hợp để hình hành vỏ virus hoàn chỉnh. Vì vậy, tại thời điểm nào thì em có thể thu được từ mẫu tôm bị bệnh những protein của virus chưa kết hợp thành vỏ hoàn chỉnh?

Anh Cường ơi! Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử cho thấy là trong tế bào các protein  được tổng hợp riêng rẽ và sau đó sẽ kết hợp lại thành virion hoàn chỉnh. Virus em đang làm thì hình hiển vi điện tử (virus đã được nhân lên trong tế bào) chủ yếu là dạng virion và nucleocapside.Em cũng không biết tại thời điểm nào thì có thể thu được từ mẫu tôm bị bệnh những protein của virus chưa kết hợp thành virion hoàn chỉnh.

Câu em viết là kô phân biệt được band 40 với 55 là sao anh không hiểu?

Em muốn nói là nhìn hinh điện di mình chỉ có thể đoán là band đó có trọng lượng phân tử (TLPT) khoảng đó thôi chứ không xác định được đó là band của virus hay tế bào.Các band 40, 55 kDa là các band mà theo tài liệu nước ngoài công bố là của virus mình quan tâm thì khi mình thấy các band trọng khoảng đó mình có xu hướng nghĩ nó là các band mình mong muốn nhưng thực chưa chắc mà có thể là 38,39, 41, 42 (đối với band 40 kDa) hay là 53, 54, 56, 57 (đối với 55 kDa).

 

[Dương Văn Cường]

Em muốn nói là nhìn hinh điện di mình chỉ có thể đoán là band đó có trọng lượng phân tử (TLPT) khoảng đó thôi chứ không xác định được đó là band của virus hay tế bào.Các band 40, 55 kDa là các band mà theo tài liệu nước ngoài công bố là của virus mình quan tâm thì khi mình thấy các band trọng khoảng đó mình có xu hướng nghĩ nó là các band mình mong muốn nhưng thực chưa chắc mà có thể là 38,39, 41, 42 (đối với band 40 kDa) hay là 53, 54, 56, 57 (đối với 55 kDa).

Chắc chắn là vậy Minh Anh ạ. Nhìn bản điện di chỉ là bước đầu tiên, cho người ta một cái nhìn phác thảo. Dữ liệu này thường là không đủ để đưa ra một kết luận. Vì vậy em nên tiến hành Western blot càng sớm càng tốt.

Anh Cường ơi! Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử cho thấy là trong tế bào các protein ?được tổng hợp riêng rẽ và sau đó sẽ kết hợp lại thành virion hoàn chỉnh. Virus em đang làm thì hình hiển vi điện tử (virus đã được nhân lên trong tế bào) chủ yếu là dạng virion và nucleocapside.Em cũng không biết tại thời điểm nào thì có thể thu được từ mẫu tôm bị bệnh những protein của virus chưa kết hợp thành virion hoàn chỉnh.

Anh cho rằng em nên liên hệ điều này với 3 đường chạy số 8,9 và 10. Chịu khó tìm đọc tài liệu, cần tài liệu gì mọi người sẽ giúp em.

 

[cuongdhqt2000]

Điện di SDS - PAGE

Em có vấn đề đang thắc mắc, nhờ các anh chị giúp đỡ: Vừa rồi em pha gel điện di SDS nhưng gel không đông. Em nghĩ do vấn đề là acrylamide của em để cũng khá lâu rồi (3-4 năm gì đó). Vậy cho em hỏi acrylamide có dễ bị biến tính khi bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thường không? Có cách nào để kiểm tra xem acrylamide bị biến tính không? Các anh chị giải thích giúp em với. Em cảm ơn nhiều!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Gel không đông nguyên nhân chủ yếu là do APS bạn ạ. Acrylamide của bạn cũ thì cũng có thể là nguyên nhân. Tuy nhiên bạn có thể thử pha lại APS mới hoàn toàn và thử lại với acrylamide cũ xem.

 

[cfareast]

Em có vấn đề đang thắc mắc, nhờ các anh chị giúp đỡ: Vừa rồi em pha gel điện di SDS nhưng gel không đông. Em nghĩ do vấn đề là acrylamide của em để cũng khá lâu rồi (3-4 năm gì đó). Vậy cho em hỏi acrylamide có dễ bị biến tính khi bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thường không? Có cách nào để kiểm tra xem acrylamide bị biến tính không? Các anh chị giải thích giúp em với. Em cảm ơn nhiều!

Làm khoa học phải biết đặt giả thiết, loại trừ.
Không đông, có hàng tá các nguyên nhân, acrylamide chỉ là 1 trong số đó. Chịu khó nghĩ và thực hành! Không ai có thể trả lời bạn nguyên nhân chính xác, do pH, do mM buffer, do temed, do APS, hay % gel ???? Phải thử mới biết.


Tốt nhất pha lại hết các thành phần!

 

[nathanly]

phương pháp western blot

có anh chị nảo có tà liệu về pp western blot ko chỉ em vời. em cảm ơn ak!