Chào các bác! Em đang cần tách plasmid. Em dùng Midi kit của Qiagen. Vấn đề là có lúc em tách thu được nồng độ plasmid cao, có lúc thì thu được nồng độ rất thấp (tất cả plasmid đều là high copy) mặc dù đã tăng thể tích dịch nuôi vi khuẩn lên 4 lần (100 ml). Em băn khoăn không biết mình đã sai sót ở bước nào. Mong các tiền bối chỉ giáo giùm em nhanh nhanh với ạ!
Thắc mắc dùng Midi kit
- Thread starter ngaytho
- Start date
có thay đổi bước nào trong protocol của nó không? Sự khác nhau về lượng plasmid thu được có khác nhau ở từng mẻ thí nghiệm, hay khác nhau từng mẫu trong 1 mẻ?
Tôi ko nhớ rõ lắm nhưng có bước sau khi tủa Isopropanol thì thay vì ly tâm tốc độ tối đa 15min thì tôi có tăng lên 30min. Bước rửa EthOH 70% rất dễ rơi pellet nên dùng pipet hút ra (không dốc ngược ống để đổ). Ví dụ có 500ul EthOH thì hút ra 450 ul rồi đặt vào máy ly tâm spin 2min rồi hút nốt chỗ còn lại.
Tôi ko nhớ rõ lắm nhưng có bước sau khi tủa Isopropanol thì thay vì ly tâm tốc độ tối đa 15min thì tôi có tăng lên 30min. Bước rửa EthOH 70% rất dễ rơi pellet nên dùng pipet hút ra (không dốc ngược ống để đổ). Ví dụ có 500ul EthOH thì hút ra 450 ul rồi đặt vào máy ly tâm spin 2min rồi hút nốt chỗ còn lại.
Nếu với large size plasmid, hình như bạn nên đun nóng cái elution buffer lên 65 độ rồi elution với thể tích nhỏ nhất có thể.
Trước khi miniprep bạn nên làm one-step để kiểm tra xem liệu vấn đề là do khâu nuôi, chủng/hay do quy trình tách.
Protocol làm one-step rất đơn giản:
+ lấy khoảng 400 ul dịch nuôi
+ ly tâm 2 phút top-speed thu tế bào
+ Cho 20 ul PCI và 40 ul 6xloading buffer vào
+ Vortex 1 phút
+ Ly tâm 10 phút
+ Hút 10 ul dịch nổi đem điện di để quan sát nồng độ plasmid của bạn.
Trước khi miniprep bạn nên làm one-step để kiểm tra xem liệu vấn đề là do khâu nuôi, chủng/hay do quy trình tách.
Protocol làm one-step rất đơn giản:
+ lấy khoảng 400 ul dịch nuôi
+ ly tâm 2 phút top-speed thu tế bào
+ Cho 20 ul PCI và 40 ul 6xloading buffer vào
+ Vortex 1 phút
+ Ly tâm 10 phút
+ Hút 10 ul dịch nổi đem điện di để quan sát nồng độ plasmid của bạn.
Hic. Ly tâm như vậy sợ còn nhiều cặn quá nó block cái màng của bạn luôn. Khả năng là bước ly tâm rồi.
Không ly tâm nữa mà bỏ lên giấy lọc rồi trực tiếp lên cột. Trước đó thì nhớ làm ẩm giấy lọc.
voh5
Senior Member
Lâu lắm không làm, với lại toàn làm nhiều với mini kit chứ midi và maxi kit thì chỉ làm mấy lần! tuy nhiên, em nhớ không nhầm thì trong các kit của Qiagen, tuân thủ đúng yêu cầu của nhà sản xuất về quy trình thực hiện là tối quan trọng. Có một vài điểm note nếu bác đang thực sự làm cái Plasmid Midi kit của Qiagen theo em nhớ nhé:
+ Chuẩn bị các dung dịch P1,P2, N3 theo đúng hướng dẫn, ví dụ như bổ sung RNase A vào P1, rồi làm tan (nếu không nhầm thì là cái SDS) trong P2 (Kinh nghiệm của em trước kia là chia nhỏ chai P2 ra, rồi dùng lượt nào thì ta ...xào lượt đấy, chứ cứ bỏ ra bỏ vào trong water bath ở 37oC cũng không tốt ^_^), rồi làm lạnh N3 ở 4oC...
++ Ly tâm thu tế bào ở tốc độ cao, vào ly tâm lạnh nhé, các bác để ý giùm là nhà sản xuất yêu cầu đâu ly tâm đạt tới 6000xg thì phải.
+ Ở bước bổ sung N3 thì làm càng nhanh càng tốt, em cũng không giải thích được, nhưng bổ sung N3 xong mà không lắc càng nhanh càng tốt, cho nhiều cặn vón lại thì ... thất bại càng cao. Xong rồi ủ đá 15 phút >>>riêng em toàn chơi luôn ủ 30 phút!!!
+++ Ly tâm dung dịch với mấy ly tâm lạnh ở tốc độ cao (các bác để ý là, lượng mẫu ly tâm tầm 12 ml, có chia đôi ra thì cũng phải dùng ống 5-7ml, hoạc không thì cũng dùng ống falcon 15ml để ly tâm, với lực yêu cầu là trên 20000x g, nghĩa là dùng máy ly tâm lạnh tốc độ cao ấy nhé! Cái này theo em quan trọng nhất, vì loại protein hay tạp chất hay ko là ở chỗ này!
Còn đoạn sau thì phụ thuộc vào màng lọc của hãng rồi, coi như đã hoàn thành công việc, em chỉ nhớ có lần không bổ sung QBT lên màng trước mà cũng chẳng có vấn đề gì xảy ra
, vẫn thu plasmid tốt, keke. Ở đây, em không hiểu là tại sao ly tâm chỉ tới được 4000rpm (chắc lực ly tâm sẽ vào khoảng 3000xg ) mà bác cũng có thể làm được midi kit của Qiagen thôi? hay là kit mới nhỉ? trước (hồi 2005-2006) em toàn dùng code 12145 thì phải.Mừ bác dùng từ Sol III thì em càng ngạc nhiên nữa, không biết mình lạc đề hay không? Đang nói dùng kit midi của Qiagen, lại thòi ra quả tách chiết bằng Sol I, Sol II, Sol III của Sambrook....????
Nè ban! Sau khi cho S3 (của mình không phải N3) thì không được phép ủ dung dịch lysate trên đá. Mà ly tâm lạnh cũng không đúng vì theo mình biết thì protein không kết tủa được ở nhiệt độ thấp. Mình dùng Midi kit Qiagen code 12943Lâu lắm không làm, với lại toàn làm nhiều với mini kit chứ midi và maxi kit thì chỉ làm mấy lần! tuy nhiên, em nhớ không nhầm thì trong các kit của Qiagen, tuân thủ đúng yêu cầu của nhà sản xuất về quy trình thực hiện là tối quan trọng. Có một vài điểm note nếu bác đang thực sự làm cái Plasmid Midi kit của Qiagen theo em nhớ nhé:
+ Chuẩn bị các dung dịch P1,P2, N3 theo đúng hướng dẫn, ví dụ như bổ sung RNase A vào P1, rồi làm tan (nếu không nhầm thì là cái SDS) trong P2 (Kinh nghiệm của em trước kia là chia nhỏ chai P2 ra, rồi dùng lượt nào thì ta ...xào lượt đấy, chứ cứ bỏ ra bỏ vào trong water bath ở 37oC cũng không tốt ^_^), rồi làm lạnh N3 ở 4oC...
++ Ly tâm thu tế bào ở tốc độ cao, vào ly tâm lạnh nhé, các bác để ý giùm là nhà sản xuất yêu cầu đâu ly tâm đạt tới 6000xg thì phải.
+ Ở bước bổ sung N3 thì làm càng nhanh càng tốt, em cũng không giải thích được, nhưng bổ sung N3 xong mà không lắc càng nhanh càng tốt, cho nhiều cặn vón lại thì ... thất bại càng cao. Xong rồi ủ đá 15 phút >>>riêng em toàn chơi luôn ủ 30 phút!!!
+++ Ly tâm dung dịch với mấy ly tâm lạnh ở tốc độ cao (các bác để ý là, lượng mẫu ly tâm tầm 12 ml, có chia đôi ra thì cũng phải dùng ống 5-7ml, hoạc không thì cũng dùng ống falcon 15ml để ly tâm, với lực yêu cầu là trên 20000x g, nghĩa là dùng máy ly tâm lạnh tốc độ cao ấy nhé! Cái này theo em quan trọng nhất, vì loại protein hay tạp chất hay ko là ở chỗ này!
Còn đoạn sau thì phụ thuộc vào màng lọc của hãng rồi, coi như đã hoàn thành công việc, em chỉ nhớ có lần không bổ sung QBT lên màng trước mà cũng chẳng có vấn đề gì xảy ra
Mừ bác dùng từ Sol III thì em càng ngạc nhiên nữa, không biết mình lạc đề hay không? Đang nói dùng kit midi của Qiagen, lại thòi ra quả tách chiết bằng Sol I, Sol II, Sol III của Sambrook....????
Tach midi-prep cung dua tren cung 1 ngtac la alkaline/SDS DNA extraction. The nen nhung thanh phan co ban cua P1/P2/N3(P3) theo cach goi cua ban cung giong (hoac tao moi truong tuong tu) voi SolI/SolII/SolIII.
Ly do phai han che thoi gian (khong qua 3 min) u voi P2(SolII), hay noi cach khac la cho P3(SolIII) som la de tranh nhiem tap DNA chromosome cua vi khuan vao DNA plasmid. Chi tiet xem ngtac alkaline/SDS extraction va ly do chinh pH o SolIII (P3).
Khi su dung may ly tam co rotor vang (swing-out) thi toc do thuong khong vuot qua dc 5.000rpm; muon dat duoc toc do cao hon thi phai dung rotor fix-angle. Nhung luu y cac ong falcon tube khac nhau co kha nang chiu toc do khac nhau. Thuong cung chi chiu duoc 7.000rpm hoac hon 1 ti (xem chi tiet tren bao bi). Neu muon toc do cao thi phai dung ong ly tam chuyen dung (nghia la phai reuse?). Thuc te toi nghi buoc ly tam loai protein nay dung 7.000rpm 15min 4oC la OK roi. Nhung toi thay nhieu ng prefer su dung giay loc hon trong truong hop medi-prep /maxi-prep.
N5 (DNA suspension buffer) thi dung la nen bo vao 45/50oC truoc 1 thoi gian.
P2 nen cho vao 37/30oC doi voi nhung lab o EU trong mua dong khi RT duoi 20oC. P2 tot nhat la fresh.
Ly do phai han che thoi gian (khong qua 3 min) u voi P2(SolII), hay noi cach khac la cho P3(SolIII) som la de tranh nhiem tap DNA chromosome cua vi khuan vao DNA plasmid. Chi tiet xem ngtac alkaline/SDS extraction va ly do chinh pH o SolIII (P3).
Khi su dung may ly tam co rotor vang (swing-out) thi toc do thuong khong vuot qua dc 5.000rpm; muon dat duoc toc do cao hon thi phai dung rotor fix-angle. Nhung luu y cac ong falcon tube khac nhau co kha nang chiu toc do khac nhau. Thuong cung chi chiu duoc 7.000rpm hoac hon 1 ti (xem chi tiet tren bao bi). Neu muon toc do cao thi phai dung ong ly tam chuyen dung (nghia la phai reuse?). Thuc te toi nghi buoc ly tam loai protein nay dung 7.000rpm 15min 4oC la OK roi. Nhung toi thay nhieu ng prefer su dung giay loc hon trong truong hop medi-prep /maxi-prep.
N5 (DNA suspension buffer) thi dung la nen bo vao 45/50oC truoc 1 thoi gian.
P2 nen cho vao 37/30oC doi voi nhung lab o EU trong mua dong khi RT duoi 20oC. P2 tot nhat la fresh.
Lê Đức Dũng
Senior Member
cứ làm đúng y như hướng dẫn của nhà sx là ok, và chỉ chú ý thao tác cẩn thận một chút nhất là khi hút supernatant đừng hút ky quá ma hút hết cả pellet.
khi centrifug thì để ý la rpm hay x g để điều chỉnh hợp lý.
gì nữa nhỉ, ah xem cái máy đo DNA của bạn còn có chính xác ko, mình bị vài làn về cái máy chết tiệt, nên phải thử trên Gel cho chắc.
khi centrifug thì để ý la rpm hay x g để điều chỉnh hợp lý.
gì nữa nhỉ, ah xem cái máy đo DNA của bạn còn có chính xác ko, mình bị vài làn về cái máy chết tiệt, nên phải thử trên Gel cho chắc.
voh5
Senior Member
Hihihi, đúng là em không biết bác dùng code nào, em quen dùng cái thằng Q. Plasmid midi kit, còn bác thì dùng thằng Q. plasmid PLUS midi kit, nên mới ông nói gà - bà nói vịt! Sorry bác trước đã!
Em thuộc thành phần không khoa học, làm cu-li lâu rồi nên phàm cái gì thuộc protocol của các KIT là em theo hết, không sửa chữa nhiều. Có modify thì chỉ khi mình làm như kiểu Sol như bác Hiếu nói ở dưới thôi, vì hầu hết các nhà sản xuất đã tối ưu hết rồi.
Cũng như bác Hiếu nói ở dưới, em hiểu sơ sơ là các protocol tách này về cơ bản khá giống nhau, tên gọi của dịch này-ống kia chẳng qua là tên thương mại thôi. Tuy nhiên, điểm khác chính, theo em, sẽ là công nghệ dùng màng lọc loại nào trong từng loại kit của hãng. Mà khác nhau ntn thì ... em chịu.
Cũng tò mò tí nên em thử xem code 12943 của bác là gì, và đọc qua cái, nên cũng nói luôn với bác là về ly tâm trong cái kit này, ở trang 17 -
QIAGEN Plasmid Plus Purification Handbook 01/2009 có ghi rõ là với midi kit thì bác cần ly tâm ở 10,000 x g với Midi và maxi format, còn Mega và Giga format thì cần ly tâm tới 5,000 x g cho ống 50ml (rotor văng) đấy bác. Còn ảnh hưởng của của ly tâm nóng hay lạnh như thế nào với tủa ADN/Protein thì em chịu, vì em chỉ làm theo, take note xem những làm mình làm đúng/sai mà rút kinh nghiệm thôi, không có điều kiện thử với kit
.Thank bác Hiếu phát nào
! Bác này làm nhiều quá, cái gì cũng biết! Anh em lại được nhờ!!!!
Ly tâm trên 7000 rpm không dùng được Falcon 50 ml. Thủng ngay.
Phải dùng ống ly tâm Beckman, hoặc nếu thể tích trên 100 ml thì dùng container 250 ml cũng của Beckman.
Phải dùng ống ly tâm Beckman, hoặc nếu thể tích trên 100 ml thì dùng container 250 ml cũng của Beckman.
voh5
Senior Member
Cái thứ nhất là 7000rpm nhưng lực (g-force) là bao nhiêu đã bác.
Cái thứ 2 là tùy ống và adapter nữa bác à. Ống falcon là cách gọi chung thôi (falcon - conical tube - centrfuge tube...)...
Cái thứ 3 là Beckman cũng chỉ là một hãng, có lẽ do bác dang dùng máy của BCI và ống của nó nên bác nói PHẢI thôi, các hãng khác ống cũng đầy, ví dụ như Hitachi, Thermo Sofwal chẳng hạn... Mà không cứ là ống của thằng nào, quan trọng trong ống ly tâm là: kiểu ống, chất liệu ống và các thông số giới hạn như: tốc độ, lực, k-factor ...
Xin hỏi không rõ bác nói về cái N5 ((DNA suspension buffer) là cái gì ạ?
DNA suspension buffer la dung dich lam tan DNA tren membrane (column) va minh thu dc fraction chua DNA. Nhiet do a'm lam tan DNA tot hon.
Thuong co nguoi su dung ddH2O hoac TE buffer de lam DNA suspension buffer
Thuong co nguoi su dung ddH2O hoac TE buffer de lam DNA suspension buffer
