Cho em hỏi về dựng đường chuẩn trong real time PCR

[Hoàng Thị Bích Thủy]

Em có đọc được một số tài liệu nói về cách dựng đường chuẩn trong real time PCR dùng để định lượng. Tuy nhiên, em thấy có 2 ý kiến thế này, các bác giải thích hộ em với nhé:
1. Các mẫu dùng để dựng đường chuẩn phải là mẫu đã biết chính xác số copy: bộ mẫu chuẩn phải có khoảng 4 nồng độ đã biết chính xác số copy
2. Chỉ cần 1 mẫu biết chính xác số copy, từ đó pha loãng ra nhiều nồng độ: mục đích là kiểm tra thao tác pha loãng có chính xác hay ko.
Các bác giúp em với.

 

[Vũ Thị Hoàn]

Cau thu 2 dung, nhung khong phai muc dich de KT thao tac pha loang co chinh xac hay khong, ma thao tac buoc phai chinh xac. Va tu cac nong do khac nhau do co the dung lam Control samples va de xay dung duong chuan.

 

[Hoàng Thị Bích Thủy]

Nhưng tại sao những hãng sx kit vẫn pha sẵn các nồng độ từ cao đến thấp nhằm mục đích dựng đường chuẩn

 

[Vũ Thị Hoàn]

Neu ban tu pha loang va su dung no de dung duong chuan thi ban dat duoc ca hai muc dich, do la vua KT duoc thao tac, vua co duong chuan. Neu su dung cac kit pha san ban se khong KT duoc thao tac, vi vay khi lam real time PCR nen tu pha positive control.

 

[Ho Huu Tho]

Theo bạn Hoàn thì dựa vào đâu để đánh giá thao tác pha loãng có chính xác hay không?

 

[Vũ Thị Hoàn]

Dua vao Ct cua negative control, he so tuong quan R va PCR efficiency (E%)

 

[Ho Huu Tho]

@ Hoàn: Vậy khi nào bạn sẽ nhận định là thao táo pha loãng không chuẩn xác?

 

[Vũ Thị Hoàn]

Cai nay chac a/Tho biet ro vi voi nguoi lam real time PCR ai cung phai tim tai lieu de doc truoc khi tien hanh cac TN.

 

[Hoàng Thị Bích Thủy]

Nếu như theo bạn Hoàn nói thì có phải là mình có thể đặt hàng từ các công ty hóa chất một loại hóa chất chứa một nồng độ chất đã biết chính xác số copy (ví dụ: mình đang làm về real time PCR định lượng P35S - promotor của trình tự dùng chuyển gen ở thực vật- thì mình có thể đặt mua 1 hóa chất chứa số copy p35S đã biết trước, rồi tự pha loãng nhiều lần, làm đường chuẩn để định lượng cho những mẫu mà mình muốn biết)

 

[Đinh Duy Thành]

Tự pha để tiết kiệm chi phí, và đặt hàng chuẩn để kiểm tra/hiệu chỉnh nồng độ sau khi pha ^_^

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Viec pha loang dung duong chuan ko fai la xac dinh pha loang chinh xac hay ko ma xac dinh range nong do ma o do gia tri Cf phu thuoc tuyen tinh voi nong do template.

2. Thong thuong dung duong chuan = chinh gene/san pham PCR cua minh van tot hon so voi dung 1 san pham PCR khac (cua hang). Lay cap primer nhan san pham PCR tu DNA genome. Tinh sach bang san pham nay, xac dinh nong do DNA chinh xac roi tien hanh pha loang cac fold khac nhau, dung nhung DNA dilutions nay de lam template cho viec chay real-time PCR => dung duong chuan

 

[Hoàng Thị Bích Thủy]

Nhưng bác Hiếu ơi, làm sao mình có thể xác định chính xác số copy của mẫu của mình dùng làm mẫu chuẩn được???

 

[Cao Xuân Hiếu]

Mình có thể dùng bảng tính dưới đây

http://www.genscript.com/conversion.html

 

[Vũ Thị Hoàn]

Minh vua tim duoc trang web rat hay, giup moi nguoi co the tinh duoc so ban copies DNA, xin share cung moi nguoi.
http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html

 

[Ho Huu Tho]

Khi chấp nhận tính số copy theo trang web ở trên, ít nhất là các bạn đã chấp nhận hai sai số:
1. Sai số từ việc quy đổi quang phổ hấp thụ tử ngoại sang nồng độ của axit nucleic.
2. Sai số từ việc cho rằng khổi lượng phân tử của axit nucleic chỉ phụ thuộc vào chiều dài của nó.
Vậy để áp dụng vào từng trường hợp cụ thể, theo mình các bạn cần ước lượng xem mức sai số đó là khoảng bao nhiêu và có chấp nhận được trong ứng dụng của mình hay không.

 

[Vũ Thị Hoàn]

Vay a/Tho co phuong phap tinh so ban copy nao ma co it sai so hon nhu vay khong thi share cho moi　nguoi di ah.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Thọ đo nồng độ DNA bằng phương pháp nào?

 

[Ho Huu Tho]

Vay a/Tho co phuong phap tinh so ban copy nao ma co it sai so hon nhu vay khong thi share cho moi　nguoi di ah.

- Có một số phương pháp đo nồng độ ít sai số hơn như: Picogreen assay, digital PCR,...
- Cách tính khối lượng phân tử của axit nucleic dựa vào số lượng từng nucleotide A, T, G, C sẽ ít sai số hơn là chỉ dựa vào chiều dài.

Thọ đo nồng độ DNA bằng phương pháp nào?

Mình chưa tự làm mẫu chuẩn cho Realtime PCR bao giờ nên không có kinh nghiệm về việc này.