Genomic DNA pellet

[Nguyễn Ngọc Lương]

Câu hỏi này có vẻ chuối, nhưng không hỏi thì chẳng bao giờ "khôn" lên được.
Em tách genomic DNA của vài loài nấm. Nhìn chung thì ở nấm men nó là 1 cục pellet màu trắng. Còn ở C. Phlei thì là 1 cục trong trong. Nhiều người bảo DNA tinh sạch sẽ không thấy cục gì cả, nhưng khi hòa tan vẫn có DNA. Còn cái cục trong suốt to to có thể là protein. Nhưng kết cục em tách phenol bao nhiêu lần vẫn có cục to to trong suốt đó, và hòa tan và TE thì nó vẫn tan như thường.
Thế rốt cục DNA pellet thường nó sẽ "trông" như thế nào?

 

[Ho Huu Tho]

Câu hỏi này có vẻ chuối, nhưng không hỏi thì chẳng bao giờ "khôn" lên được.
Em tách genomic DNA của vài loài nấm. Nhìn chung thì ở nấm men nó là 1 cục pellet màu trắng. Còn ở C. Phlei thì là 1 cục trong trong. Nhiều người bảo DNA tinh sạch sẽ không thấy cục gì cả, nhưng khi hòa tan vẫn có DNA. Còn cái cục trong suốt to to có thể là protein. Nhưng kết cục em tách phenol bao nhiêu lần vẫn có cục to to trong suốt đó, và hòa tan và TE thì nó vẫn tan như thường.
Thế rốt cục DNA pellet thường nó sẽ "trông" như thế nào?

Anh Lương có kết quả đo phổ của A260/A280 của cả hai trường hợp chưa ạ, nếu có thì kết quả như thế nào ạ?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Theo em DNA pellet có màu trong suốt và hòa H2O tan ngay. DNA pellet màu trắng là bị lẫn nhiều muối, lúc hòa có thể không tan, nhiều vẩn đục nhưng tăng H2O lên thì tan sau đó tủa lại và rủa nhiều lần = 70% EthOH là hết bệnh.

DNA bị lẫn protein sẽ ko nhìn được/ phân biệt được vì đa số protein cũng tan tốt trong nước.

 

[Biologist]

Câu hỏi này có vẻ chuối, nhưng không hỏi thì chẳng bao giờ "khôn" lên được.
Em tách genomic DNA của vài loài nấm. Nhìn chung thì ở nấm men nó là 1 cục pellet màu trắng. Còn ở C. Phlei thì là 1 cục trong trong. Nhiều người bảo DNA tinh sạch sẽ không thấy cục gì cả, nhưng khi hòa tan vẫn có DNA. Còn cái cục trong suốt to to có thể là protein. Nhưng kết cục em tách phenol bao nhiêu lần vẫn có cục to to trong suốt đó, và hòa tan và TE thì nó vẫn tan như thường.
Thế rốt cục DNA pellet thường nó sẽ "trông" như thế nào?

Lương: Vì Bạn đang làm việc với filamentous fungi, Tôi đoán là DNA pellet của Bạn có lẫn nhiều polysaccharides (từ cell wall). Nếu thật như vậy thì có nhiều protocols có thể giúp Bạn remove polysaccharides from DNA samples (dùng 1M NaCl hoặc 12% polyethylene glycol 8000). Bạn có thể thử Google xem protocol nào đã được dùng thành công cho filamentous fungi.

Chuc thanh cong,

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Cám ơn anh David. Thật ra nếu là polysaccharide thì chỉ bực là nó hiện diện ở đó thôi chứ làm thí nghiệm không bị ảnh hưởng gì. Mà có lẽ đúng là polysaccharide thật bởi pellet to đùng mà DNA thì vẫn ít.
Pellet màu trắng thì làm DNA hay RNA nấm men đều có màu như thế. Rửa bằng cồn 70% vẫn còn màu trắng đó. Để khô thì nó thành trong veo.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Giờ mới biết thêm 1 điều nữa. Sau phenol extraction, phenol nó vẫn lẫn vào upper aqueous phase và cần CCl3 extraction một lần nữa. Nhất là khi ly tâm ở RT.
Thế để loại enzyme khỏi mẫu của mình, chiết bằng phenol:chloroform:isoamyl thì tốt hơn phenol đúng không nhỉ?

 

[Biologist]

Giờ mới biết thêm 1 điều nữa. Sau phenol extraction, phenol nó vẫn lẫn vào upper aqueous phase và cần CCl3 extraction một lần nữa. Nhất là khi ly tâm ở RT.
Thế để loại enzyme khỏi mẫu của mình, chiết bằng phenol:chloroform:isoamyl thì tốt hơn phenol đúng không nhỉ?

Có phải Lương cần phải loại bỏ enzyme sau khi restriction digestion hay không? Nếu như vậy thì khi Tôi còn là một postdoc (cách đây khoảng 15 năm), Tôi thường dùng phenol:chloroform:isoamyl, sau do extract aqueous phase thêm một lần nữa bang chloroform:isoamyl. Hiện nay, trong các biotech companies, các R&D scientists tránh dùng phenol, cho nên họ thường dùng các spin-columns (commercially available).

Chuc thanh cong,

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Dạ, đúng rồi anh David. Em vẫn thường 3 bước Phenol: PCI và CI. Nhưng bọn lab nó lười nó chỉ ghi phenol extraction. Mấy lần trước làm xong phenol extraction thì rửa bằng cồn nên không để ý chuyện phenol còn sót lại trong aqueous phase. Hồi trước hay ly tâm phenol ở 4 độ C. Lần này ly tâm ở nhiệt độ phòng. Nghe bảo ly tâm phenol ở 4 độ C không tốt bằng RT, mặc dù ở RT thì nhiệt độ tăng lên lại làm phenol hòa tan trong aqueous phase nhiều hơn.

Hôm trước vừa bị 1 vố nữa. Đứa nào ở lab táy máy đánh vào thêm RNase vào đệm hòa tan genomic DNA trong protocol. Báo hại cả lab làm theo cả năm trời nay. Đến hôm em làm phát hiện ra, thế là GS kêu cả lab lại chửi cho một trận te tua

 

[Ho Huu Tho]

Đứa nào ở lab táy máy đánh vào thêm RNase vào đệm hòa tan genomic DNA trong protocol. Báo hại cả lab làm theo cả năm trời nay. Đến hôm em làm phát hiện ra, thế là GS kêu cả lab lại chửi cho một trận te tua

Theo anh Lương thì khi cho RNase vào đệm hòa tan gDNA thì mất gì và được gì ạ? Em không hiểu vì sao có một người nào đó muốn cho vào, còn một số người khác thì không muốn cho vào.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

RNase làm ảnh hưởng đến một số thí nghiệm khác. Ví dụ RNase có thể lẫn DNase và khi làm Southern coi như tiêu (cắt enzyme ủ qua đêm). Hoặc khi sequencing, PCR, RE digestion...v.v.
Người ta thường chỉ cho RNase vào ngay khi sử dụng mẫu genomic DNA đó chứ không cho vào để làm stock cất. Thậm chí TE buffer chưa chắc đã tốt. Tốt nhất là dùng nuclease free water (chai elution buffer thường dùng cho các kit miniphowaoawcj gel elution) để hòa tan genomic DNA.

 

[Ho Huu Tho]

RNase làm ảnh hưởng đến một số thí nghiệm khác. Ví dụ RNase có thể lẫn DNase và khi làm Southern coi như tiêu (cắt enzyme ủ qua đêm). Hoặc khi sequencing, PCR, RE digestion...v.v

Có phải ý của anh Lương là nếu RNase mà không bị lẫn DNase thì không việc gì phải không ạ? Em cũng thắc mắc tại sao RNase lại có thể lẫn DNase ạ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Không hẳn thế. RNase là một enzyme, nên nó có thể ức chế một số thí nghiệm làm việc với DNA chứa RNase, ví dụ PCR, sequencing. Đó là kinh nghiệm một số người chia sẻ. Tôi chưa gặp trường hợp RNase làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm này.

 

[Vũ Thị Hoàn]

Trong nhung mot so truong hop nguoi ta can cho Rnase vao trong qua trinh extract DNA nham tinh sach, vi du nhu dung DNA de lam DNA-DNA hybridization.