Thắc mắc về quy trình tách chiết DNA

#1
Trong quy trình tách chiết DNA bằng SDS, em chỉ sử dụng chloroform cho việc biến tính protein, thay vì phải sử dụng kết hợp với phenol và isoamyl alcohol (vì lab em ko sử dụng 2 loại hóa chất này). Như vậy, liệu có sự khác biệt gì đáng kể ko? xin cảm ơn mọi người
 

cfareast

Member
Những hóa chất đó cũng dễ mua mà, đầy ở cửa hàng lẻ

Nếu ko có, tách chloroform cũng được. Mình tách dna chạy pcr, cắt = nuclease... cũng chẳng làm sao cả .
 
Do pha phenol mấy anh chị nói độc, với lại em cũng chưa pha bao giờ cả. Vậy nếu em sử dụng chloroform ko thôi thì độ tinh sạch của DNA so với sử dụng phenol thì có khác biệt nhiều lắm ko? vì em đang làm để lấy số liệu viết khóa luận tốt nghiệp.
 
Theo mình thì như thế này, đầu tiên phải nói rõ SDS là chất tẩy mạnh dùng để phá màng tb, ngoài ra người ta còn sử dụng cả sarcosyl. sau đó mang đi li tâm, mình thu được dịch nổi chứa acid nucleic. Phần dịch nổi này còn chứa cả các tạp chất khác nhưng đa số là protein.
Tại sao lại cho hỗn hợp Phenol:chlorofrom. Phenol là chất gây biến tính protein mạnh mà không gây ảnh hưởng đến acid nu, chúng biến các protein từ dạng tan trong dung môi thành dạng tủa, còn chloroform, đây là chất gây biến tính protein nhưng nhẹ hơn. Mục đích chính của chất này là trung hòa lượng phenol dư để tránh bị lây nhiễm tạp chất lên acid nu.
Trường hợp của bạn (chắc là tách chiến DNA ở tb gan động vật), bn chỉ sử dụng chloroform thì hiệu quả của quá trình tinh sạch nu là rất kém, sẽ còn lẫn tạp chất rất nhiều. Mình chưa thử làm nhưng theo suy đoán thì chắc OD260nm / OD 280nm của bạn sẽ nằm ngoài khoảng 1.8 đến 2.
Pha chế và sử dụng thêm phenol đi nhé bạn. Hóa chất nào cũng độc cả, tùy thuộc vào tính động và ngưỡng gây độc thôi, bạn thao tác cẩn thận và trong điều kiện ok thì no pờ rốp bờ lầm. :D
 

nhumai2005

New member
Hic, c?c bạn g? font chữ g? m? m?nh đọc kh?ng được, m?nh đang cần dung dịch phenol để pha hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol để t?ch chiết DNA, nhưng hiện m?nh chỉ c? phenol tinh thể. M?nh phải pha thế n?o để c? dd phenol d?ng đ?y? Bạn n?o biết chỉ gi?p m?nh với nh?! Tks nhiều lắm.
 

cfareast

Member
Font bạn NHUMAI2005 khó đọc quá!

Phenol cho vào làm biến tính và kết tủa protein (chắc mất hẳn hoạt tính các protease, nuclease....). Còn chloroform thì làm kết tủa, nhưng ko rõ có làm biến tính các protease hay nuclease hay ko? Phương pháp nổi tiếng sevag dùng loại protein khỏi polysaccharides chỉ dùng chloroform và butanol mà ko dùng phenol.

Phenol tinh thể, phải chế biến tương đối mất công mới sử dụng được. Lâu rồi mình cũng quên chi tiết. Chỉ nhớ các điểm sau:

- Làm tan chảy phenol tinh thể ở khoảng 60oC
- Dùng TrisHCL pH 8, đổ vào, khuấy từ vài tiếng. Để lắng, loại bỏ supernatant, rồi lại lặp lại... vài lần đến khi pH dịch nổi =8 (cân bằng phenol đến pH8).
- Còn có bước bổ sung chất chống ooxxy hóa, làm hỏng phenol (Mình ko nhớ rõ tên chất).

- Nếu làm không khéo, thì từ 1 lít dịch phenol, bạn chỉ còn vài chục hoặc 100ml cuối cùng. Chẳng hiểu đi đâu mất!

Chế biến phenol thì phải làm trong tủ hút, nếu không thì mùi độc hại vô cùng.

Bạn cứ hỏi bác google.com là có protocol cụ thể.
 
Trong quy trình tách chiết DNA bằng SDS, em chỉ sử dụng chloroform cho việc biến tính protein, thay vì phải sử dụng kết hợp với phenol và isoamyl alcohol (vì lab em ko sử dụng 2 loại hóa chất này). Như vậy, liệu có sự khác biệt gì đáng kể ko? xin cảm ơn mọi người
Hi
Mấy vấn đề này, em chỉ cần tìm hiểu kỹ bản chất của từng hóa chất đó có vai trò gì trong việc tách chiết ADN. Đồng thời hiểu rõ đối tượng tách chiết ADN đấy là gì? (Thực vật hay động vật, nhiều polysaccharides hay không....).
Tóm lại:
- Chloroform thì chắc chắn phải có.
- Phenol thì cần hoặc không cần. Nếu có nhiều polysaccharides thì nên sử dụng.
- Isoamyl alcohol: Cần hoặc không cần. Vì nó chỉ sử dụng để ổn định phenol.

P/S: khi đã hiểu kỹ về từng loại hóa chất, ý nghĩa của từng bước tách chiết thì có thể: làm một ngày cũng xong mà làm 1-2 tiếng cũng xong. Tùy cơ ứng biến.
 

nhumai2005

New member
Font bạn NHUMAI2005 khó đọc quá!

Phenol cho vào làm biến tính và kết tủa protein (chắc mất hẳn hoạt tính các protease, nuclease....). Còn chloroform thì làm kết tủa, nhưng ko rõ có làm biến tính các protease hay nuclease hay ko? Phương pháp nổi tiếng sevag dùng loại protein khỏi polysaccharides chỉ dùng chloroform và butanol mà ko dùng phenol.

Phenol tinh thể, phải chế biến tương đối mất công mới sử dụng được. Lâu rồi mình cũng quên chi tiết. Chỉ nhớ các điểm sau:

- Làm tan chảy phenol tinh thể ở khoảng 60oC
- Dùng TrisHCL pH 8, đổ vào, khuấy từ vài tiếng. Để lắng, loại bỏ supernatant, rồi lại lặp lại... vài lần đến khi pH dịch nổi =8 (cân bằng phenol đến pH8).
- Còn có bước bổ sung chất chống ooxxy hóa, làm hỏng phenol (Mình ko nhớ rõ tên chất).

- Nếu làm không khéo, thì từ 1 lít dịch phenol, bạn chỉ còn vài chục hoặc 100ml cuối cùng. Chẳng hiểu đi đâu mất!

Chế biến phenol thì phải làm trong tủ hút, nếu không thì mùi độc hại vô cùng.

Bạn cứ hỏi bác google.com là có protocol cụ thể.

Cảm ơn bạn cfareast đ? trả lời gi?p m?nh nh?! Nhưng m? m?nh đọc kh?ng ddc, kh?ng hiểu sao m? chữ nhảy font t?m lum ?. Bạn đ?nh chữ theo font n?o vậy? để m?nh copy ra word rồi chuyển font đọc. Tks bạn nh?!
 

pdn

Pham Duy Nghia
Cảm ơn bạn cfareast đ� trả lời gi�p m�nh nh�! Nhưng m� m�nh đọc kh�ng ddc, kh�ng hiểu sao m� chữ nhảy font t�m lum �. Bạn đ�nh chữ theo font n�o vậy? để m�nh copy ra word rồi chuyển font đọc. Tks bạn nh�!
lăn chuột xuống cuối web này, đổi english thành vietnamese xem được không ạ.!
:rose:
 

traicay93

New member
tại sao phenol có khả năng biến tính protein? trong giai đoạn biến tính protein, thì isoamylalcohol được bổ sung với mục đích gì? còn sự khác biệt giữa phương pháp tủa bằng ethanol lạnh và tủa bằng isopropanol và giải thích dùm e sự khác biệt này nữa....... mấy anh chị biết, giải đáp thắc mắt dùng em nha,.... cảm ưn nhìu ,
 

avoalie

Member
Có bạn nào biết cách tách DNA từ agarose gel mà không dùng kits hok, có ai từng thử chưa, chỉ mình với. Thân !
 

Facebook

Top