The E3 Ubiquitin Ligase IDOL Induces the Degradation of the Low Density Lipoprotein Receptor Family Members VLDLR and ApoER2

[Ho Huu Tho]

#29.1
We have previously identified the E3 ubiquitin ligase-inducible degrader of the low density lipoprotein receptor (LDLR) (Idol) as a post-translational modulator of LDLR levels. Idol is a direct target for regulation by liver X receptors (LXRs), and its expression is responsive to cellular sterol status independent of the sterol-response element-binding proteins. Here we demonstrate that Idol also targets two closely related LDLR family members, VLDLR and ApoE receptor 2 (ApoER2), proteins implicated in both neuronal development and lipid metabolism. Idol triggers ubiquitination of the VLDLR and ApoER2 on their cytoplasmic tails, leading to their degradation. We further show that the level of endogenous VLDLR is sensitive to cellular sterol content, Idol expression, and activation of the LXR pathway. Pharmacological activation of the LXR pathway in mice leads to increased Idol expression and to decreased Vldlr levels in vivo. Finally, we establish an unexpected functional link between LXR and Reelin signaling. We demonstrate that LXR activation results in decreased Reelin binding to VLDLR and reduced Dab1 phosphorylation. The identification of VLDLR and ApoER2 as Idol targets suggests potential roles for this LXR-inducible E3 ligase in the central nervous system in addition to lipid metabolism.

Để tiện theo dõi, mời các bạn xem [URL="http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?p=42962#post42962"]Trang chủ của topic[/URL]

 

[Ho Huu Tho]

#29.1
We have previously identified the E3 ubiquitin ligase-inducible degrader of the low density lipoprotein receptor (LDLR) (Idol) as a post-translational modulator of LDLR levels. Idol is a direct target for regulation by liver X receptors (LXRs), and its expression is responsive to cellular sterol status independent of the sterol-response element-binding proteins. Here we demonstrate that Idol also targets two closely related LDLR family members, VLDLR and ApoE receptor 2 (ApoER2), proteins implicated in both neuronal development and lipid metabolism. Idol triggers ubiquitination of the VLDLR and ApoER2 on their cytoplasmic tails, leading to their degradation. We further show that the level of endogenous VLDLR is sensitive to cellular sterol content, Idol expression, and activation of the LXR pathway. Pharmacological activation of the LXR pathway in mice leads to increased Idol expression and to decreased Vldlr levels in vivo. Finally, we establish an unexpected functional link between LXR and Reelin signaling. We demonstrate that LXR activation results in decreased Reelin binding to VLDLR and reduced Dab1 phosphorylation. The identification of VLDLR and ApoER2 as Idol targets suggests potential roles for this LXR-inducible E3 ligase in the central nervous system in addition to lipid metabolism.

Ubiquitin ligase E3 Idol tăng cường sự thoái biến các thành viên VLDLR và ApoER2 của họ thụ cảm thể lipoprotein tỉ trọng thấp
Trước đây, chúng tôi đã xác định được tác nhân gây thoái biến thụ cảm thể lipoprotein tỉ trọng thấp (LDLR) (Idol) cảm ứng với ubiquitin ligase E3 như là một tác nhân điều biến sau dịch mã của mức độ LDLR. Idol là đích trực tiếp để điều hòa bởi các thụ cảm thể X của gan (các LXR), và sự biểu hiện của nó đáp lại trạng thái sterol của tế bào mà không phụ thuộc vào các protein element - binding đáp ứng lại sterol. Ở đây chúng tôi mô tả rằng Idol còn nhắm đến hai thành viên của họ LDLR quan hệ chặt chẽ với nhau là VLDLR và thụ cảm thể ApoE 2 (ApoER2), là các protein liên quan đến cả sự phát triển thần kinh và chuyển hóa lipid. Idol khởi động sự ubiquitin hóa của VLDLR và ApoER2 tại các đuôi phía bên trong tế bào và dẫn đến sự thoái biến của chúng. Xa hơn, chúng tôi còn chỉ ra rằng mức độ của VLDLR nội sinh nhạy cảm với hàm lượng sterol của tế bào, với sự biểu hiện của Idol và với sự hoạt hóa của con đường LXR. Sự hoạt hóa dược lý của con đường LXR ở chuột nhắt dẫn đến tăng biểu hiện của Idol và giảm mức độ của VLDLR in vivo. Cuối cùng, chúng tôi thiết lập một mối liên quan chức năng ngoài dự tính giữa LXR với tín hiệu Reelin. Chúng tôi mô tả rằng sự hoạt hóa LXR dẫn đến kết quả làm giảm sự gắn kết của Reelin vào VLDLR và giảm phosphoryl hóa của Dab1. Việc xác định VLDLR và ApoER2 như là các đích của Idol gợi ý các vai trò tiềm năng của E3 ligase cảm ứng LXR này ở hệ thần kinh trung ương bên cạnh chuyển hóa lipid.

 

[Ho Huu Tho]

#29.2
Introduction

The LDLR7 family of membrane receptors consists of type I membrane proteins that participate in endocytic and cellular signaling processes. The LDLR, the namesake of the family, is essential for the uptake of extracellular LDL cholesterol (1). As such, it is a critical determinant of plasma lipoprotein levels and a target for human cardiovascular therapeutics. Mutations in this receptor are the leading cause of familial hypercholesterolemia, a disease characterized by reduced hepatic LDL clearance, elevated plasma cholesterol levels, and accelerated cardiovascular disease (2,–,4).

Expression of the LDLR is tightly regulated at both the transcriptional and post-transcriptional levels. Transcription of the LDLR gene is regulated primarily by sterol response element-binding protein (SREBP) transcription factors whose activity is sensitive to endoplasmic reticulum cholesterol levels (5, 6). A reduction in cellular cholesterol levels leads to the processing of SREBPs to their mature nuclear forms and the subsequent activation of genes important for cholesterol uptake and de novo cholesterol synthesis (7). Mechanisms for post-translational modulation of the LDLR pathway include LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1/ARH) (8) and PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin 9) (9,–,12), which influence LDLR stability, endocytosis, and trafficking.

We have recently identified the E3 ubiquitin ligase Idol (inducible degrader of the LDLR) as a transcriptional target of LXRs and a post-transcriptional regulator of the LDLR pathway (13). Unlike the LDLR and PCSK9 genes, Idol is not regulated by SREBPs. Therefore, LXR-dependent induction of Idol defines a complementary but distinct pathway for sterol-dependent inhibition of cellular cholesterol uptake through the LDLR. Idol triggers ubiquitination of the LDLR on conserved residues in its intracellular tail, leading to degradation of the receptor. Consistent with this mechanism, overexpression of Idol potently reduces LDLR protein levels in vitro and in vivo and inhibits LDL uptake. Conversely, knockdown of Idol expression leads to an increase in LDLR protein and LDL uptake.

Among the LDLR family of proteins, the VLDLR (very low density lipoprotein receptor) and ApoER2 (also known as LRP8) share the highest overall sequence homology with the LDLR (14). Whereas the metabolic role of the LDLR is well established, study of the metabolic roles of VLDLR and ApoER2 has been complicated by the overlapping substrate specificity of LDLR family members (15). On the other hand, studies in recent years have established a critical role for VLDLR and ApoER2 in the neuronal Reelin pathway that is essential for proper neuronal positioning and brain development (16,–,19). A body of evidence demonstrates that the VLDLR and ApoER2 interact with an extracellular ligand, Reelin, leading, as a first event, to phosphorylation of the adaptor molecule Dab1 (20, 21).

In this study, we identify the VLDLR and ApoER2 as novel targets of Idol. Similar to the LDLR, these receptors are targeted by Idol for degradation through a post-translational mechanism dependent on the ubiquitination of conserved residues in their intracellular tail (13). We further show that the function of Idol is evolutionarily conserved and that the level of endogenous VLDLR is sensitive to cellular sterol levels and LXR activation both in vitro and in vivo. Finally, we provide evidence of cross-talk between the LXR-Idol pathway and Reelin signaling. Our findings suggest that Idol may have a role in the CNS in addition to its role in lipid metabolism.

Để tiện theo dõi, mời các bạn xem Trang chủ của topichttp://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?p=42962#post42962

 

[Ho Huu Tho]

#29.2
Introduction
The LDLR7 family of membrane receptors consists of type I membrane proteins that participate in endocytic and cellular signaling processes. The LDLR, the namesake of the family, is essential for the uptake of extracellular LDL cholesterol (1). As such, it is a critical determinant of plasma lipoprotein levels and a target for human cardiovascular therapeutics. Mutations in this receptor are the leading cause of familial hypercholesterolemia, a disease characterized by reduced hepatic LDL clearance, elevated plasma cholesterol levels, and accelerated cardiovascular disease (2,–,4).

Giới thiệu
Họ các thụ cảm thể màng LDLR7 bao gồm các protein màng typ I tham gia vào các quá trình nhập bào và truyền tín hiệu của tế bào. Thụ cảm thể LDLR có cùng tên với tên của họ, giữ vai trò thiết yếu đối với sự hấp thu của cholesterol LDL ngoại bào (1). Như vậy, nó là yếu tố quyết định đối với nồng độ lipoprotein huyết tương và là đích hướng đến của các trị liệu bệnh tim mạch của người. Các đột biến ở thụ cảm thể này là nguyên nhân hàng đầu của chứng tăng cholesterol máu gia đình, một bệnh lý đặc trưng bởi giảm thanh thải LDL của gan, tăng nồng độ cholesterol huyết tương và tăng bệnh lý tim mạch (2 - 4).

Expression of the LDLR is tightly regulated at both the transcriptional and post-transcriptional levels. Transcription of the LDLR gene is regulated primarily by sterol response element-binding protein (SREBP) transcription factors whose activity is sensitive to endoplasmic reticulum cholesterol levels (5, 6). A reduction in cellular cholesterol levels leads to the processing of SREBPs to their mature nuclear forms and the subsequent activation of genes important for cholesterol uptake and de novo cholesterol synthesis (7). Mechanisms for post-translational modulation of the LDLR pathway include LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1/ARH) (8) and PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin 9) (9,–,12), which influence LDLR stability, endocytosis, and trafficking.

Biểu hiện của LDLR được điều hòa chặt chẽ ở cả mức phiên mã và mức sau phiên mã. Sự phiên mã của gen LDLR chủ yếu được điều hòa bởi các yếu tố phiên mã protein element-binding đáp ứng sterol (SREBP) mà hoạt tính của nó nhạy cảm với nồng độ cholesterol của lưới nội chất (5,6). Giảm nồng độ cholesterol tế bào dẫn đến việc biến đổi các protein SREBP thành các dạng hoàn chỉnh có nhân của chúng và sự hoạt hóa tiếp theo của các gen giữ vai trò quan trọng đối với hấp thu cholesterol và tổng hợp de novo cholesterol (7). Các cơ chế điều biến sau dịch mã của con đường LDLR bao gồm LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1/ARH) (8) và PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin 9) (9 - 12), là các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của LDLR, sự nhập bào và sự di chuyển.

We have recently identified the E3 ubiquitin ligase Idol (inducible degrader of the LDLR) as a transcriptional target of LXRs and a post-transcriptional regulator of the LDLR pathway (13). Unlike the LDLR and PCSK9 genes, Idol is not regulated by SREBPs. Therefore, LXR-dependent induction of Idol defines a complementary but distinct pathway for sterol-dependent inhibition of cellular cholesterol uptake through the LDLR. Idol triggers ubiquitination of the LDLR on conserved residues in its intracellular tail, leading to degradation of the receptor. Consistent with this mechanism, overexpression of Idol potently reduces LDLR protein levels in vitro and in vivo and inhibits LDL uptake. Conversely, knockdown of Idol expression leads to an increase in LDLR protein and LDL uptake.

Gần đây chúng tôi đã xác định ubiquitin ligase E3 Idol (tác nhân gây thoái biến LDLR có khả năng cảm ứng) như là một đích phiên mã của các LXR và yếu tố điều hòa sau phiên mã của con đường LDLR (13). Không giống với các gen LDLR và PCSK9, Idol không bị điều hòa bởi các SREBP. Bởi thế, sự gia tăng Idol phụ thuộc LXR nêu ra con đường bổ sung nhưng khác biệt để ức chế hấp thu cholesterol của tế bào qua LDLR phụ thuộc sterol. Idol khởi động sự ubiquitin hóa của LDLR tại các phần bảo thủ ở phần đuôi phía bên trong tế bào của nó, dẫn đến sự thoái biến của thụ cảm thể. Phù hợp với cơ chế này, sự tăng biểu hiện của Idol làm giảm mạnh nồng độ protein LDLR in vitro và in vivo và ức chế sự hấp thu LDL. Ngược lại, knockdown biểu hiện của Idol dẫn đến gia tăng sự hấp thu LDL và protein LDLR.

Among the LDLR family of proteins, the VLDLR (very low density lipoprotein receptor) and ApoER2 (also known as LRP8) share the highest overall sequence homology with the LDLR (14). Whereas the metabolic role of the LDLR is well established, study of the metabolic roles of VLDLR and ApoER2 has been complicated by the overlapping substrate specificity of LDLR family members (15). On the other hand, studies in recent years have established a critical role for VLDLR and ApoER2 in the neuronal Reelin pathway that is essential for proper neuronal positioning and brain development (16,–,19). A body of evidence demonstrates that the VLDLR and ApoER2 interact with an extracellular ligand, Reelin, leading, as a first event, to phosphorylation of the adaptor molecule Dab1 (20, 21).

Trong số các protein của họ LDLR, VLDLR (thụ cảm thể lipoprotein tỉ trọng rất thấp) và ApoER2 (còn gọi là LRP8) có sự tương đồng cao nhất về trình tự tổng thể với LDLR (14). Trong khi vai trò chuyển hóa của LDLR đã được xác định rõ thì nghiên cứu về các vai trò chuyển hóa của VLDLR và ApoER2 đã bị trở ngại do sự chồng ghép tính đặc hiệu cơ chất của các thành viên trong họ LDLR. (15). Mặt khác, các nghiên cứu trong những năm gần đây đã thiết lập vai trò không thể thiếu của VLDLR và ApoER2 đối với con đường thần kinh Reelin, là con đường mang tính thiết yếu cho sự phát triển não bộ và sự sắp xếp tế bào thần kinh chuẩn xác (16 - 19). Một tài liệu mô tả rằng VLDLR và ApoER2 tương tác với một phối tử ngoại bào là Reelin, dẫn đến sự phosphoryl hóa của phân tử adaptor Dab1 như là sự kiện đầu tiên(20,21)

In this study, we identify the VLDLR and ApoER2 as novel targets of Idol. Similar to the LDLR, these receptors are targeted by Idol for degradation through a post-translational mechanism dependent on the ubiquitination of conserved residues in their intracellular tail (13). We further show that the function of Idol is evolutionarily conserved and that the level of endogenous VLDLR is sensitive to cellular sterol levels and LXR activation both in vitro and in vivo. Finally, we provide evidence of cross-talk between the LXR-Idol pathway and Reelin signaling. Our findings suggest that Idol may have a role in the CNS in addition to its role in lipid metabolism.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định VLDLR và ApoER2 là những đích mới của Idol. Tương tự với LDLR, nhưng thụ cảm thể này được nhắm tới bởi Idol để phân hủy thông qua cơ chế sau dịch mã phụ thuộc vào sự ubiquitin hóa của các phần bảo thủ tại đuôi phía bên trong tế bào của chúng (13). Xa hơn, chúng tôi con chỉ ra rằng chức năng của Idol có tính bảo thủ về mặt tiến hóa và rằng nồng độ VLDLR nội sinh nhạy cảm với nồng độ sterol của tế bào và sự hoạt hóa LXR cả ở mức in vitro và in vivo. Cuối cùng, chúng tôi đưa ra bằng chứng của sự giao thoa giữa con đường LXR-Idol và tín hiệu Reelin. Kết quả của chúng tôi gợi ý rằng Idol có thể có vai trò đối với hệ thần kinh trung ương bên cạnh vai trò của nó đối với chuyển hóa lipid.

Để tiện theo dõi, mời các bạn xem Trang chủ của topichttp://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?p=42962#post42962

 

[Ho Huu Tho]

#29.3
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Cell Culture, Transfections, and Adenoviral Infection
HEK 293T cells were from the ATCC. HEK 293T-Reelin cells were a gift from Dr. Thomas Curran (Children's Hospital of Philadelphia). SNB-19 glioblastoma cells were a gift from Dr. Rene Bernards (The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, The Netherlands). The generation and maintenance of 3T3 mouse fibroblasts that stably produce VLDLR and Dab1 were previously reported (22). The cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum at 37 °C and 5% CO2. To collect Reelin-containing conditioned medium, HEK 293T-Reelin cells were grown to ∼75% confluence, washed twice with phosphate-buffered saline and cultured in Optimem medium (Invitrogen) for an additional 24 h. Conditioned medium was collected, filtered, and stored at −80 °C. HEK 293T cells were transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. In experiments testing the ability of Idol to degrade other potential protein targets, a ratio of 3:1 (IDOL:target) was used. The generation of adenoviruses encoding Idol, GFP, and Sult2b1 was previously described (13, 23). SNB-19 cells were seeded (0.5 × 10624). cells/60-mm well) and infected with adenovirus the following day at a multiplicity of infection of 80. Primary hippocampal neurons were prepared from embryonic 17-day-old rats and cultured as described (24)
Plasmids and Expression Constructs
Expression plasmids for human IDOL, mouse Idol, HA-ubiquitin, LDLR, and LpR were previously reported (13, 25). The C-terminally tagged VLDLR-HA, VLDLR-GFP, and ApoER2-HA expression constructs were gifts from Dr. George Rebeck (Georgetown University). The FLAG-Lrp1b expression plasmid was a gift from Dr. Masashi Kawaichi (Nara Institute of Science and Technology, Japan). Full-length Drosophila melanogaster Dnr1 was cloned into the gateway plasmid pDONR221 (Invitrogen). To generate mammalian expression constructs for Dnr1, we used LR recombination between pDONR221-Dnr1 and an N-terminally V5 tag DEST plasmid (Invitrogen). Site-directed mutagenesis was used to introduce mutations in VLDLR-HA and V5-Dnr1 with the QuikChange multi-site mutagenesis kit (Stratagene). An amyloid precursor protein (APP) chimeric construct, N′-APP(1–675)-LDLR(780–860)-C′, that contains the APP ecto-domain and the transmembrane and intracellular domains of the LDLR fused to a C-terminal GFP was generated by standard cloning procedures. Restriction digest analysis and DNA sequencing were used to verify the correctness of all of the constructs used in this study.
Antibodies, Immunoblot Analysis, and Immunoprecipitation
Total cell or tissue lysates were prepared in radioimmune precipitation assay buffer (150 mm NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 100 mm Tris-HCl, pH 7.4) supplemented with protease inhibitors (Roche Applied Science). The lysates were cleared by centrifugation at 4 °C for 10 min at 10,000 × g. Protein concentration was determined using the Bradford assay (Bio-Rad) with bovine serum albumin as reference. The samples (10–40 μg) were separated on NuPAGE Bis-Tris gels (Invitrogen) and transferred to nitrocellulose. The membranes were probed with the following antibodies: LDLR (Cayman Chemical, 1:2000), tubulin (Calbiochem, 1:10000), GFP (affinity-purified rabbit polyclonal anti-GFP was a gift from Dr. Mireille Riedinger, 1:5000), LpR (2189/90, 1:500) (25), HA (Covance, 1:20000), V5 (Invitrogen, 1:5000), VLDLR (Santa Cruz clone 6A6, 1:250), α74 (1:20,000) (22), Reelin (Millipore clone G10, 1:200), Dab1 (D4 mouse monoclonal antibody was a gift from Dr. Andre Goffinet, 1:1000), and phosphotyrosine (Santa Cruz PY99, 1:200). Idol was detected with polyclonal antibodies raised in rabbits against Idol (13) or with a monoclonal antibody (Abcam, 1:500). Secondary horseradish peroxidase-conjugated antibodies (Zymed Laboratories Inc.) were used and visualized with chemiluminescence (Pierce). To immunoprecipitate HA-tagged proteins, equal amounts of protein of cleared lysates were incubated with EZ view red anti-HA affinity beads (Sigma) for 16 h. Subsequently, the beads were washed four times with radioimmune precipitation assay buffer. All of the incubations and washes were done at 4 °C with rotation. The proteins were eluted from the beads by boiling in 1× protein sample buffer for 5 min. The blots were quantified by densitometry.
RNA Isolation and Quantitative PCR
Total RNA was isolated from cells and mouse tissues using TRIzol (Invitrogen). One microgram of total RNA was reverse transcribed with random hexamers using iScript reverse transcription reagents kit (Bio-Rad). Sybergreen (Applied Biosystems) real time quantitative PCR assays were performed on an Applied Biosystems 7500HT sequence detector. The results show the averages of duplicate experiments normalized to 36B4. Primer sequences are available upon request.
Metabolic Labeling of Cells
HEK 293T cells were transfected with VLDLR-HA and Idol expression plasmids. Subsequently, the cells were washed twice with phosphate-buffered saline and pulsed for 15 min with Dulbecco's modified Eagle's medium lacking methionine and cysteine (Sigma) supplemented with 200 μCi/well easy Tag express 35S protein labeling mix (PerkinElmer Life Sciences). The cells were then washed three times and chased in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum, 100 μg/ml methionine, and 500 μg/ml cysteine for the indicated times. Preparation of cell lysates and immunoprecipitation of VLDLR-HA were conducted as detailed above.
Reelin Binding and Dab1 Phosphorylation Assays
Reelin binding assays were conducted essentially as described (22). Briefly, SNB19 cells were plated at a density of 0.5 × 106 cells/60-mm well. Subsequently, the cells were washed three times with Optimem medium (Invitrogen) and incubated with Reelin-containing conditioned medium on ice. Binding was allowed to proceed for 30 min, after which cells were vigorously washed five times with phosphate-buffered saline. Preparation of cell lysates and immunodetection was conducted as detailed above. Analysis of Dab1 phosphorylation following Reelin binding was done as described (22).
Animal Experiments
C57BL/6 mice (Jackson Laboratory) were fed a standard chow diet and housed in a temperature-controlled room under a 12-h light-dark cycle under pathogen-free conditions. The mice were orally gavaged with 20 mg/kg of the indicated LXR ligand. At the time of sacrifice, the tissues were collected, immediately frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C. The tissues were processed for isolation of RNA and protein as above. The animal experiments were conducted in accordance with institutional guidelines.
Statistical Analysis
Real time PCR data and densitometry are expressed as the means ± S.D. Statistical analysis was done with a two-tailed Student's t test. A probability value of p < 0.05 was considered statistically significant.

 

[Ho Huu Tho]

#29.3
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Cell Culture, Transfections, and Adenoviral Infection
HEK 293T cells were from the ATCC. HEK 293T-Reelin cells were a gift from Dr. Thomas Curran (Children's Hospital of Philadelphia). SNB-19 glioblastoma cells were a gift from Dr. Rene Bernards (The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, The Netherlands). The generation and maintenance of 3T3 mouse fibroblasts that stably produce VLDLR and Dab1 were previously reported (22). The cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum at 37 °C and 5% CO2. To collect Reelin-containing conditioned medium, HEK 293T-Reelin cells were grown to ∼75% confluence, washed twice with phosphate-buffered saline and cultured in Optimem medium (Invitrogen) for an additional 24 h. Conditioned medium was collected, filtered, and stored at −80 °C. HEK 293T cells were transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. In experiments testing the ability of Idol to degrade other potential protein targets, a ratio of 3:1 (IDOL:target) was used. The generation of adenoviruses encoding Idol, GFP, and Sult2b1 was previously described (13, 23). SNB-19 cells were seeded (0.5 × 106 cells/60-mm well) and infected with adenovirus the following day at a multiplicity of infection of 80. Primary hippocampal neurons were prepared from embryonic 17-day-old rats and cultured as described (24).

Phương pháp nghiên cứu
Nuôi cấy tế bào, chuyển nạp và gây nhiễm virus adeno.
Các tế bào HEK 293T có nguồn gốc từ ATCC. Các tế bào HEK 293T-Reelin được Tiến sỹ Thomas Curran tặng (Viện Nhi Philadelphia). Các tế bào nguyên bào glio SNB-19 được Tiến sỹ Rene Bernards tặng (Viện nghiên cứu Ung thư Hà Lan, Amsterdam, Hà Lan). Nuôi cấy và duy trì các nguyên bào sợi của chuột nhắt 3T3 để sản xuất ổn định VLDLR và Dab1 đã được báo cáo trước đây (22). Các tế bào được giữ trong môi trường Eagle (Invitrogen) được biến đổi theo môi trường Dulbecco bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò ở 37 °C và 5% CO2. Để thu hồi môi trường chứa Reelin, các tế bào HEK 293T-Reelin được nuôi đến khoảng 75% mật độ, rửa hai lần bằng đệm phốt phát và nuôi cấy trong môi trường Optimen (Invitrogen) thêm 24 h. Môi trường đã nuôi cấy được thu hồi, lọc và lưu trữ ở −80 °C. Các tế bào HEK 293T được chuyển nạp bằng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong các thí nghiệm kiểm tra khả năng của Idol phân giải các đích protein tiềm năng khác, chúng tôi đã sử dụng tỉ lệ 3:1 (IDOL:đích). Tạo virut adeno mã hóa Idol, GFP và Sult2b1 đã được mô tả trước đây (13, 23). Các tế bào SNB-19 được cấy (0.5 × 106 tế bào/giếng 60-mm) và được gây nhiễm virut adeno vào ngày sau đo với tỉ lệ gây nhiễm là 80. Các tế bào thần kinh chính ở hồi hải mã được chuẩn bị từ chuột cống bào thai 17 ngày tuổi và được nuôi cấy như đã được mô tả ở (24).

Plasmids and Expression Constructs
Expression plasmids for human IDOL, mouse Idol, HA-ubiquitin, LDLR, and LpR were previously reported (13, 25). The C-terminally tagged VLDLR-HA, VLDLR-GFP, and ApoER2-HA expression constructs were gifts from Dr. George Rebeck (Georgetown University). The FLAG-Lrp1b expression plasmid was a gift from Dr. Masashi Kawaichi (Nara Institute of Science and Technology, Japan). Full-length Drosophila melanogaster Dnr1 was cloned into the gateway plasmid pDONR221 (Invitrogen). To generate mammalian expression constructs for Dnr1, we used LR recombination between pDONR221-Dnr1 and an N-terminally V5 tag DEST plasmid (Invitrogen). Site-directed mutagenesis was used to introduce mutations in VLDLR-HA and V5-Dnr1 with the QuikChange multi-site mutagenesis kit (Stratagene). An amyloid precursor protein (APP) chimeric construct, N′-APP(1–675)-LDLR(780–860)-C′, that contains the APP ecto-domain and the transmembrane and intracellular domains of the LDLR fused to a C-terminal GFP was generated by standard cloning procedures. Restriction digest analysis and DNA sequencing were used to verify the correctness of all of the constructs used in this study.

Các plasmid và các cấu trúc để biểu hiện
Các plasmid biểu hiện IDOL người, Idol chuột nhắt, HA-ubiquitin, LDLR và LpR đã được báo cáo trước đây (13, 25). Các cấu trúc để biểu hiện VLDLR-HA, VLDLR-GFP và APOER2-HA được gắn đuôi ở đầu C tận được Tiến sỹ George Rebeck (Đại học Georgetown) tặng. Plasmid biểu hiện FLAG-Lrp1b được Tiến sỹ Masashi Kawaichi (Viện Khoa học và Công nghệ Nara, Nhật Bản) tặng. Toàn bộ gen Dnr1 của Drosophila melanogaster đã được tạo dòng vào plasmid gateway pDONR221 (Invitrogen). Để tạo ra các cấu trúc biểu hiện của động vật có vú đối với Dnr1, chúng tôi sử dụng sự tái tổ hợp LR giữa pDONR221-Dnr1 và một plasmid DEST gắn đuôi V5 đầu N tận (Invitrogen). Gây đột biến có định hướng đã được dùng để tạo các đột biến ở gen VLDLR-HA và V5-Dnr1 bằng bộ kit QuikChange multi-site mutagenesis kit (Stratagene). Một cấu trúc ghép protein tiền thân dạng tinh bột (APP), N′-APP(1–675)-LDLR(780–860)-C′ chứa vùng APP ecto và các vùng xuyên màng và phía bên trong tế bào của LDLR gắn với GFP đầu C tận được tạo rằng bằng các quy trình tạo dòng chuẩn. Phân tích về phân cắt giới hạn và giải trình tự ADN đã được dùng để kiểm tra lại sự chính xác của các cấu trúc được sử dụng trong nghiên cứu này.

Antibodies, Immunoblot Analysis, and Immunoprecipitation
Total cell or tissue lysates were prepared in radioimmune precipitation assay buffer (150 mm NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 100 mm Tris-HCl, pH 7.4) supplemented with protease inhibitors (Roche Applied Science). The lysates were cleared by centrifugation at 4 °C for 10 min at 10,000 × g. Protein concentration was determined using the Bradford assay (Bio-Rad) with bovine serum albumin as reference. The samples (10–40 μg) were separated on NuPAGE Bis-Tris gels (Invitrogen) and transferred to nitrocellulose. The membranes were probed with the following antibodies: LDLR (Cayman Chemical, 1:2000), tubulin (Calbiochem, 1:10000), GFP (affinity-purified rabbit polyclonal anti-GFP was a gift from Dr. Mireille Riedinger, 1:5000), LpR (2189/90, 1:500) (25), HA (Covance, 1:20000), V5 (Invitrogen, 1:5000), VLDLR (Santa Cruz clone 6A6, 1:250), α74 (1:20,000) (22), Reelin (Millipore clone G10, 1:200), Dab1 (D4 mouse monoclonal antibody was a gift from Dr. Andre Goffinet, 1:1000), and phosphotyrosine (Santa Cruz PY99, 1:200). Idol was detected with polyclonal antibodies raised in rabbits against Idol (13) or with a monoclonal antibody (Abcam, 1:500). Secondary horseradish peroxidase-conjugated antibodies (Zymed Laboratories Inc.) were used and visualized with chemiluminescence (Pierce). To immunoprecipitate HA-tagged proteins, equal amounts of protein of cleared lysates were incubated with EZ view red anti-HA affinity beads (Sigma) for 16 h. Subsequently, the beads were washed four times with radioimmune precipitation assay buffer. All of the incubations and washes were done at 4 °C with rotation. The proteins were eluted from the beads by boiling in 1× protein sample buffer for 5 min. The blots were quantified by densitometry.

Các kháng thể, phân tích lai miễn dịch và ngưng kết miễn dịch
Dịch đặc tổng thể của tế bào hay mô được chuẩn bị trong dung dịch đệm thử nghiệm ngưng kết miễn dịch phóng xạ (150 mm NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% Na deoxycholate, 0.1% SDS, 100 mm Tris-HCl, pH 7.4) bổ sung các yếu tố ức chế protease (Roche Applied Science). Các dịch đặc được làm sạch bằng cách ly tâm ở 4 °C trong 10 phút và 10,000 × g. Nồng độ protein được xác định bằng thử nghiệm Bradford (Bio-Rad) với chứng là albumin huyết thanh bò. Các mẫu (10–40 μg) được phân tích trên gel NuPAGE Bis-Tris gels (Invitrogen) và được chuyển lên màng nitrocellulose. Các màng được phủ mẫu dò bởi các kháng thể sau: LDLR (Cayman Chemical, 1:2000), tubulin (Calbiochem, 1:10000), GFP (kháng thể thỏ đa dòng kháng GFP tinh sạch bằng sắc ký ái lực được tiến sỹ Mireille Riedinger tặng, 1:5000), LpR (2189/90, 1:500) (25), HA (Covance, 1:20000), V5 (Invitrogen, 1:5000), VLDLR (dòng Santa Cruz 6A6, 1:250), α74 (1:20,000) (22), Reelin (Millipore dòng G10, 1:200), Dab1 (kháng thể đơn dòng chuột nhắt D4 được tiến sỹ Andre Goffinet tặng, 1:1000), và phosphotyrosine (Santa Cruz PY99, 1:200). Idol được phát hiện bằng các kháng thể đa dòng hình thành ở thỏ chống lại Idol (13) hay bằng kháng thể đơn dòng (Abcam, 1:500). Các kháng thể thứ cấp gắn horseradish peroxidase (Zymed Laboratories Inc.) được sử dụng và hiển thị với hóa huỳnh quang (Pierce). Để ngưng kết miễn dịch các protein gắn đuôi HA, những lượng bằng nhau của protein của dịch đặc đã qua bước làm sạch được ủ với các bead ái lực EZ view red anti-HA (Sigma) trong 16h. Sau đó, các bead được rửa bốn lần bằng dung dịch đệm của thử nghiệm ngưng kết miễn dịch phóng xạ. Tất cả các bước ủ và rửa được thực hiện ở 4 °C và quay tròn. Các protein được hòa tan từ các bead bằng cách đun sôi trong đệm mẫu protein 1 lần trong 5 phút. Các kết quả lai được định lượng bằng máy đo mật độ.

RNA Isolation and Quantitative PCR
Total RNA was isolated from cells and mouse tissues using TRIzol (Invitrogen). One microgram of total RNA was reverse transcribed with random hexamers using iScript reverse transcription reagents kit (Bio-Rad). Sybergreen (Applied Biosystems) real time quantitative PCR assays were performed on an Applied Biosystems 7500HT sequence detector. The results show the averages of duplicate experiments normalized to 36B4. Primer sequences are available upon request.

Tách chiết ARN và PCR định lượng
ARN tổng số được tách chiết từ các tế bào và từ các mô của chuột nhắt sử dụng TRIzol (Invitrogen). Một microgam ARN tổng số được phiên mã ngược với mồi ngẫu nhiên hexamer và sử dụng bộ kit các hóa chất phiên mã ngược iScript (Bio-Rad). Thử nghiệm PCR định lượng realtime Sybergreen (Applied Biosystems) được tiến hành trên may đọc Applied Biosystems 7500HT. Các kết quả thể hiện các giá trị trung bình của hai lần thí nghiệm lặp lại và được chuẩn hóa với 36B4. Các trình tự mồi có sẵn theo yêu cầu.

Metabolic Labeling of Cells
HEK 293T cells were transfected with VLDLR-HA and Idol expression plasmids. Subsequently, the cells were washed twice with phosphate-buffered saline and pulsed for 15 min with Dulbecco's modified Eagle's medium lacking methionine and cysteine (Sigma) supplemented with 200 μCi/well easy Tag express 35S protein labeling mix (PerkinElmer Life Sciences). The cells were then washed three times and chased in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum, 100 μg/ml methionine, and 500 μg/ml cysteine for the indicated times. Preparation of cell lysates and immunoprecipitation of VLDLR-HA were conducted as detailed above.

Đánh dấu chuyển hóa của các tế bào
Các tế bào HEK 293T được chuyển nạp với VLDLR-HA và các plasmid biểu hiện Idol. Sau đó, các tế bào được rửa hai lần với đệm muối phốt phát và phát xung 15 phút với môi trường Eagle được biến đổi theo Dulbecco bị thiếu methionine và cysteine (Sigma) và bổ sung thêm 200 μCi hỗn hợp đánh dấu protein easy Tag express 35S (PerkinElmer Life Sciences)/giếng. Các tế bào sau đó được rửa ba lần và được cho vào môi trường Eagle biến đổi theo Dulbecco chứa 10% huyết thanh bào thai bò, 100 μg/ml methionine và 500 μg/ml cysteine với số lần xác định trước. Chuẩn bị dịch đặc các tế bào và ngưng kết miễn dịch của VLDLR-HA được tiến hành như trình bày chi tiết trên đây.

Reelin Binding and Dab1 Phosphorylation Assays
Reelin binding assays were conducted essentially as described (22). Briefly, SNB19 cells were plated at a density of 0.5 × 106 cells/60-mm well. Subsequently, the cells were washed three times with Optimem medium (Invitrogen) and incubated with Reelin-containing conditioned medium on ice. Binding was allowed to proceed for 30 min, after which cells were vigorously washed five times with phosphate-buffered saline. Preparation of cell lysates and immunodetection was conducted as detailed above. Analysis of Dab1 phosphorylation following Reelin binding was done as described (22).

Thử nghiệm gắn Reelin và phosphoryl hóa Dab1
Các thử nghiệm gắn Reelin được tiến hành về căn bản như được mô tả ở (22). Một cách ngắn gọn là, các tế bào SNB19 được cấy vào đĩa với mật độ 0.5x106/giếng 60mm. Sau đó, các tế bào được rửa ba lần bằng môi trường Optimem (Invitrogen) và ủ trên đá với môi trường nuôi cấy chứa Reelin. Quá trình gắn diễn ra trong 30 phút, sau đó các tế bào được rửa mạnh năm lần bằng đệm muối phốt phát. Chuẩn bị các dịch đặc tế bào và phát hiện miễn dịch được tiến hành như được nêu chi tiết ở trên. Phân tích phosphoryl hóa của Dab1 sau khi gắn Reelin được thực hiện như được mô tả ở (22).

Animal Experiments
C57BL/6 mice (Jackson Laboratory) were fed a standard chow diet and housed in a temperature-controlled room under a 12-h light-dark cycle under pathogen-free conditions. The mice were orally gavaged with 20 mg/kg of the indicated LXR ligand. At the time of sacrifice, the tissues were collected, immediately frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C. The tissues were processed for isolation of RNA and protein as above. The animal experiments were conducted in accordance with institutional guidelines.

Các thí nghiệm trên động vật
Dòng chuột C57BL/6 (Phòng thí nghiệm Jackson) được cho ăn bằng thức ăn chuẩn và ở trong phòng điều hòa nhiệt độ với chu kỳ sáng tối 12 h và điều kiện không có tác nhân gây bệnh. Chuột nhắt được cho uống phối tử LXR nhất định với liều 20 mg/kg. Tại thời điểm giết vật thí nghiệm, các mô được thu hồi, bảo quản lạnh tức thì trong ni tơ lỏng và lưa ở −80 °C. Các mô được xử lý để tách chiết ARN và protein như trên. Các thí nghiệm trên động vật được tiến hành phù hợp với hướng dẫn của các viện nghiên cứu.

Statistical Analysis
Real time PCR data and densitometry are expressed as the means ± S.D. Statistical analysis was done with a two-tailed Student's t test. A probability value of p < 0.05 was considered statistically significant.

Các phân tích thống kê
Số liệu PCR real time và đo mật độ được biểu diễn dưới dạng trung bình ± S.D. Các phân tích thống kê được thực hiện với phân tích t Student hai phía. Giá trị xác suất của p < 0.05 được xem là có ý nghĩa thống kê.

Để tiện theo dõi, mời các bạn xem Trang chủ của topic

 

[Ho Huu Tho]

#29.4
RESULTS
The LXR Pathway Modulates the Levels of the VLDLR and ApoER2
We have recently shown that activation of LXRs diminishes LDLR protein levels and identified the E3 ubiquitin ligase Idol as the mediator of this effect (13). We therefore investigated whether other LDLR family members might be targets for the LXR-Idol pathway. We focused in particular on the most closely related proteins, VLDLR and ApoER2. Expression of these receptors is lost in most immortalized cell lines. However, inspection of the Biogps expression data revealed that glioblastoma cell lines express high levels of the VLDLR. We therefore tested the effect of two structurally unrelated LXR ligands on protein levels of this receptor. In SNB19 glioblastoma cells, we detect the VLDLR as two bands that likely represent the precursor and mature (fully glycosylated) receptor (Fig. 1A). Treatment of these cells with GW3965 or T0901317 increased the level of the LXR-responsive protein ABCA1 and concomitantly decreased the levels of the endogenous VLDLR (Fig. 1A). This reduction was not a result of decreased VLDLR expression. Whereas expression of the LXR target genes ABCA1 and IDOL were increased, that of the VLDLR remained unchanged (Fig. 1B). In similar studies, we also found that ligand-activated LXR decreased the level of VLDLR and APOER2 in 3T3 fibroblasts stably expressing these receptors (Fig. 1C) (22).

FIGURE 1. The LXR pathway modulates the level of the VLDLR and ApoER2. A, immunoblot analysis of total SNB19 cell lysates cells following treatment with 1 μm GW3965 (GW) or 1 μm T0901317 (T0) for 24 h. B, expression of ABCA1, IDOL, and VLDLR was analyzed in SNB19 cells treated for 24 h with 1 μm of the indicated ligand (n = 4). C, NIH-3T3 cells that stably produce either Vldlr or ApoER2 were treated for 24 h with 1 μm ligand. Subsequently, total cell lysates were analyzed by immunoblotting. D, gene expression was determined in SNB19 cells that were infected with the indicated adenoviruses for 24 h and subsequently treated for an additional 24 h as shown. E, immunoblot analysis of these cells (n = 3). The blots are representative of at least two independent experiments. The bars and error bars represent the means ± S.D. ***, p < 0.001. DMSO, dimethyl sulfoxide.



To investigate the link between endogenous LXR ligands and VLDLR expression, we utilized an adenovirus expressing oxysterol sulfotransferase (Sult2b1) (13, 23). Depletion of oxysterol LXR agonists by Sult2b1 in SNB19 cells decreased expression of LXR target genes as expected and had no effect on VLDLR expression (Fig. 1D). Nevertheless, this treatment increased VLDLR protein, and this effect was reversed by a synthetic LXR ligand (Fig. 1E). Cumulatively, these results suggest that LXR signaling can post-transcriptionally modulate the protein levels of the VLDLR and APOER2.
The reduced level of these receptors by activation of LXR was not limited to cells in culture but was also evident in vivo. Pharmacological dosing of mice with GW3965 led to induction of the LXR pathway in metabolic tissues without affecting VLDLR expression (Fig. 2A). Induction of Idol expression in these tissues was of a similar magnitude to that observed for the canonical LXR target gene Abca1. Concomitantly, we observed a decrease of VLDLR in skeletal muscle from these mice in response to LXR activation (Fig. 2, B and C). Conversely, we found that the level of Vldlr is increased in the brains of mice lacking LXRs (supplemental Fig. S1). Cumulatively, our results suggest that activation of LXR reduces protein levels of VLDLR and ApoER2 both in vitro and in vivo without affecting their transcript levels.

FIGURE 2. The LXR-IDOL pathway modulates the level of the VLDLR in vivo. A, C57Bl/6 mice (n = 4–6 mice/group) were orally gavaged for 3 days with the indicated ligand (20 mg/kg/day). Expression of Abca1, Idol, and VldlrS. Muscle, skeletal muscle; WAT, white adipose tissue. B and C, immunoblot analysis of Vldlr in skeletal muscle of C57Bl/6 mice pharmacologically dosed with an LXR ligand. The intensity of Vldlr was normalized to that of tubulin and is plotted. Skeletal muscle from a Vldlr−/− mouse was used as a negative control. The bars and error bars represent the means ± S.D. *, p < 0.05. DMSO, dimethyl sulfoxide; GW, GW3965; T0, T0901317. in several metabolic tissues was determined.

 

[Ho Huu Tho]

#29.4
RESULTS
The LXR Pathway Modulates the Levels of the VLDLR and ApoER2
We have recently shown that activation of LXRs diminishes LDLR protein levels and identified the E3 ubiquitin ligase Idol as the mediator of this effect (13). We therefore investigated whether other LDLR family members might be targets for the LXR-Idol pathway. We focused in particular on the most closely related proteins, VLDLR and ApoER2. Expression of these receptors is lost in most immortalized cell lines. However, inspection of the Biogps expression data revealed that glioblastoma cell lines express high levels of the VLDLR. We therefore tested the effect of two structurally unrelated LXR ligands on protein levels of this receptor. In SNB19 glioblastoma cells, we detect the VLDLR as two bands that likely represent the precursor and mature (fully glycosylated) receptor (Fig. 1A). Treatment of these cells with GW3965 or T0901317 increased the level of the LXR-responsive protein ABCA1 and concomitantly decreased the levels of the endogenous VLDLR (Fig. 1A). This reduction was not a result of decreased VLDLR expression. Whereas expression of the LXR target genes ABCA1 and IDOL were increased, that of the VLDLR remained unchanged (Fig. 1B). In similar studies, we also found that ligand-activated LXR decreased the level of VLDLR and APOER2 in 3T3 fibroblasts stably expressing these receptors (Fig. 1C) (22).

KẾT QUẢ
Con đường LXR điều biến mật độ của VLDLR và ApoER2
Gần đây chúng tôi đã chỉ ra rằng sự hoạt hóa của các LXR làm giảm mật độ của protein LDLR và xác định ubiquitin ligase E3 như là một yếu tố trung gian của hiệu ứng này (13). Bởi thế, chúng tôi đã nghiên cứu xem các thành viên khác của họ LDLR có thể là các đích của con đường LXR-Idol hay không. Chúng tôi đặc biệt tập trung vào các protein liên quan với nhau chặt chẽ nhất là VLDLR và ApoER2. Sự biểu hiện của các thụ cảm thể này biến mất ở hầu hết các dòng tế bào bất tử. Tuy nhiên, khảo sát kỹ dữ liệu về biểu hiện của Biogps cho thấy các dòng nguyên bào glio biểu hiện mạnh VLDLR. Bởi thế, chúng tôi đánh giá hiệu quả của hai phối tử của LXR không liên quan với nhau về mặt cấu trúc đối với mật độ protein của thụ cảm thể này. Ở các nguyên bào glio SNB19, chúng tôi phát hiện được VLDLR là hai băng có vẻ như là thụ cảm thể tiền thân và trưởng thành (đường hóa đầy đủ) (Hình 1A). Xử lý những tế bào này với GW3965 hay T0901317 làm gia tăng nồng độ protein đáp ứng LXR là ABCA1 và đồng thời giảm nồng độ của VLDLR nội sinh (Hình 1A). Sự giảm này không phải là kết quả của giảm biểu hiện VLDLR. Trong khi sự biểu hiện của các gen đích của LXR là ABCA1 và IDOL được gia tăng thì sự biểu hiện của VLDLR vẫn giữ không thay đổi (Hình 1B). Trong các nghiên cứu tương tự, chúng tôi cũng thấy rằng LXR được hoạt hóa bởi phối tử làm giảm mật độ VLDLR và APOER2 ở các nguyên bào sợi 3T3 là tế bào biểu hiện ổn định những thụ cảm thể này (Hình 1C) (22)

FIGURE 1. The LXR pathway modulates the level of the VLDLR and ApoER2. A, immunoblot analysis of total SNB19 cell lysates cells following treatment with 1 μm GW3965 (GW) or 1 μm T0901317 (T0) for 24 h. B, expression of ABCA1, IDOL, and VLDLR was analyzed in SNB19 cells treated for 24 h with 1 μm of the indicated ligand (n = 4). C, NIH-3T3 cells that stably produce either Vldlr or ApoER2 were treated for 24 h with 1 μm ligand. Subsequently, total cell lysates were analyzed by immunoblotting. D, gene expression was determined in SNB19 cells that were infected with the indicated adenoviruses for 24 h and subsequently treated for an additional 24 h as shown. E, immunoblot analysis of these cells (n = 3). The blots are representative of at least two independent experiments. The bars and error bars represent the means ± S.D. ***, p < 0.001. DMSO, dimethyl sulfoxide.

HÌNH 1. Con đường LXR điều biến mật độ của VLDLR và ApoER2. A, Phân tích lai miễn dịch của dịch đặc tế bào SNB19 sau khi xử lý với 1 μm GW3965 (GW) hay 1 μm T0901317 (T0) trong 24 h. B, biểu hiện của ABCA1, IDOL và VLDLR được phân tích ở các tế bào SNB19 được xử lý trong 24h bằng 1 μm phối tử cho trước (n = 4). C, Các tế bào NIH-3T3 tổng hợp ổn định Vldlr hay ApoER2 đã được xử lý trong 24 h vởi 1 μm phối tử. Sau đó, dịch đặc toàn thể của tế bào được phân tích bằng lai miễn dịch. D, biểu hiện gen được xác định ở các tế bào SNB19 đã gây nhiễm bởi các vi rút adeno cho trước trong 24 h và sau đó xử lý thêm 24 h như đã nêu. E, phân tích lai miễn dịch của những tế bào này (n = 3). Các kết quả lai đại diện cho ít nhất hai thí nghiệm độc lập. Các cột và cột sai số đại diện cho giá trị trung bình ± S.D. ***, p < 0.001. DMSO, dimethyl sulfoxide.

To investigate the link between endogenous LXR ligands and VLDLR expression, we utilized an adenovirus expressing oxysterol sulfotransferase (Sult2b1) (13, 23). Depletion of oxysterol LXR agonists by Sult2b1 in SNB19 cells decreased expression of LXR target genes as expected and had no effect on VLDLR expression (Fig. 1D). Nevertheless, this treatment increased VLDLR protein, and this effect was reversed by a synthetic LXR ligand (Fig. 1E). Cumulatively, these results suggest that LXR signaling can post-transcriptionally modulate the protein levels of the VLDLR and APOER2.

Để khảo sát mối liên hệ giữa các phối tử LXR nội sinh và biểu hiện của VLDLR, chúng tôi đã sử dụng một vi rút adeno biểu hiện oxysterol sulfotransferase (Sult2b1) (13,23). Triệt tiêu các chất đồng vận oxysterol LXR bằng Sult2b1 trong các tế bào SNB19 làm giảm biểu hiện của các gen đích LXR như dự tính và không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của VLDLR (Hình 1D). Tuy nhiên, biện pháp xử lý này làm tăng protein VLDLR và hiệu ứng này bị đảo ngược bởi các phối tử LXR tổng hợp (Hình 1E). Tóm lại, những kết quả này gợi ý rằng tín hiệu LXR có thể điều biến sau phiên mã mức độ protein của VLDLR và APOER2.

The reduced level of these receptors by activation of LXR was not limited to cells in culture but was also evident in vivo. Pharmacological dosing of mice with GW3965 led to induction of the LXR pathway in metabolic tissues without affecting VLDLR expression (Fig. 2A). Induction of Idol expression in these tissues was of a similar magnitude to that observed for the canonical LXR target gene Abca1. Concomitantly, we observed a decrease of VLDLR in skeletal muscle from these mice in response to LXR activation (Fig. 2, B and C). Conversely, we found that the level of Vldlr is increased in the brains of mice lacking LXRs (supplemental Fig. S1). Cumulatively, our results suggest that activation of LXR reduces protein levels of VLDLR and ApoER2 both in vitro and in vivo without affecting their transcript levels.

Mức độ đã bị giảm của những thụ cảm thể này do sự hoạt hóa của LXR không chỉ giới hạn ở các tế bào được nuôi cấy mà còn rõ ràng ở mức độ cơ thể. Dùng liều dược lý ở chuột nhắt với GW3965 đã làm tăng con đường LXR ở các mô chuyển hóa mà không ảnh hưởng tới biểu hiện của VLDLR (Hình 2A). Tăng biểu hiện Idol ở những tổ chức này tương tự với tăng biểu hiện của gen đích chuẩn Abca1 của LXR. Đồng thời, chúng tôi quan sát thấy sự giảm VLDLR ở cơ xương ở những chuột nhắt đáp ứng lại sự hoạt hóa LXR (Hình 2 B và C). Ngược lại, chúng tôi thấy rằng mức độ Vldlr tăng ở não chuột nhắt thiếu các LXR (Hình bổ sung. S1). Tóm lại, những kết quả của chúng tôi gợi ý rằng sự hoạt hóa của LXR làm giảm mức độ protein của VLDLR và ApoER2 ở cả mức độ in vitro và in vivo mà không ảnh hưởng đến mức độ ARN của chúng.

FIGURE 2. The LXR-IDOL pathway modulates the level of the VLDLR in vivo. A, C57Bl/6 mice (n = 4–6 mice/group) were orally gavaged for 3 days with the indicated ligand (20 mg/kg/day). Expression of Abca1, Idol, and VldlrS. Muscle, skeletal muscle; WAT, white adipose tissue. B and C, immunoblot analysis of Vldlr in skeletal muscle of C57Bl/6 mice pharmacologically dosed with an LXR ligand. The intensity of Vldlr was normalized to that of tubulin and is plotted. Skeletal muscle from a Vldlr−/− mouse was used as a negative control. The bars and error bars represent the means ± S.D. *, p < 0.05. DMSO, dimethyl sulfoxide; GW, GW3965; T0, T0901317. in several metabolic tissues was determined.

HÌNH 2. Con đường LXR-IDOL điều biến mức độ VLDLR ở mức độ in vivo. A, chuột nhắt C57Bl/6 (n = 4-6 chuột/nhóm) được cho ăn trong 3 ngày bằng phối tử được chỉ định (20 mg/kg/ngày). Sự biểu hiện của Abca1, Idol và VldlrS. Muscle, cơ xương; WAT, tổ chức mỡ trắng. B và C, phân tích lai miễn dịch của Vldlr ở cơ xương của chuột nhắt C57Bl/6 được dùng liều dược lý với một phối tử LXR. Mật độ của Vldlr được chuẩn hóa theo mật độ của tubulin và được lập đồ thị. Cơ xương của chuột Vldlr -/- đã được sử dụng làm chứng âm. Các cột và cột sai số đại diện cho số trung bình ± S.D. *, p < 0.05. DMSO, dimethyl sulfoxide; GW, GW3965; T0, T0901317. trong nhiều mô chuyển hóa đã được xác định.

 

[Ho Huu Tho]

#29.5
Idol Degrades the VLDLR and ApoER2
We have previously shown that the LXR-IDOL pathway targets the LDLR for degradation but not the related family members LRP1, SorLA, and LRP4 (13). Degradation by IDOL requires the presence of a highly conserved lysine residue that is adjacent to the NPVY endocytosis motif present in the intracellular domain of the LDLR (Fig. 3A). Because this residue is highly conserved in the VLDLR and ApoER2, we tested whether IDOL underlies the LXR-mediated reduction of these receptors. In co-transfection experiments in HEK 293 cells, we found that both human and mouse IDOL reduce the level of the VLDLR and ApoER2, in addition to LDLR (Fig. 3B). Introducing an inactivating point mutation in the IDOL RING domain (C387A) (13) abrogated the effect on these receptors. Consistent with our previous studies of LDLR degradation, the most prominent effect of Idol was observed on the level of the mature (fully glycosylated) VLDLR and ApoER2 proteins. We confirmed that LXR requires Idol to reduce the levels of these receptors by knocking down Idol expression. A 70% reduction in Idol expression resulted in an increased basal level of VLDLR in 3T3-VLDLR cells and largely abrogated the ability of activated LXR to reduce the level of this receptor (supplemental Fig. S2). Unexpectedly, IDOL did not reduce the level of LRP1b, as may have been predicted based on sequence homology (Fig. 3, A and B) or the level of another NPVY-containing receptor, the epidermal growth factor receptor (data not shown). Our results further indicate that the substrate specificities of IDOL and PCSK9 overlap, because previous studies have suggested that PCSK9 can also reduce the protein levels of VLDLR and ApoER2 (26, 27).

FIGURE 3.
IDOL targets the LDLR, VLDLR, and ApoER2 for degradation and is evolutionarily conserved. A, alignment of the intracellular domains of the human (h) LDLR, human VLDLR, mouse (m) ApoER2, L. migratoria LpR (lmLpr), and mouse Lrp1b. The triangles represent the conserved lysine following the NPVY endocytic motif and the cysteine that is ubiquitinated in the LDLR (13). The ApoER2 sequence is cut because of space considerations. B–E, HEK 293T cells were co-transfected with the indicated plasmids, and the total cell lysates were analyzed by immunoblotting as indicated. WT, wild type; MT, mutant. The blots are representative of at least two independent experiments.

The intracellular domain of the LDLR is critical for IDOL-dependent degradation. We have previously found that a mutant LDLR lacking the intracellular domain is resistant to IDOL-mediated degradation (13). We show here that replacing the natural intracellular domain of APP, which is not targeted by IDOL, with that of the LDLR allowed IDOL to target the chimeric receptor for destruction (Fig. 3C). This result demonstrates that the intracellular domain is both necessary and sufficient to direct Idol-dependent degradation of plasma membrane proteins.
The function of members of the LDLR family of receptors is evolutionarily conserved. Accordingly, we find that IDOL degrades the LpR, an ancient LDLR-related receptor from the migrating locust (Locusta migratoria) that is important for lipoprotein uptake in this species (Fig. 3, A and D) (25). We next asked the reciprocal question of whether the function of IDOL itself is evolutionarily conserved. We identified IDOL homologs in both vertebrate and nonvertebrate species (supplemental Fig. S3). The D. melanogaster Dnr1 gene is a distant homolog of mammalian IDOL (28). Remarkably, Dnr1 degraded the human LDLR and VLDLR dependent on an intact RING domain (Fig. 3E). Dnr1 is an inhibitor of the inflammatory IMD pathway in flies (28). However, despite the fact that both Dnr1 and IDOL degrade the LDLR and VLDLR, IDOL was unable to inhibit the IMD pathway in S2 cells (supplemental Fig. S4). In conclusion, these results suggest that the ability of IDOL to degrade members of the LDLR family is an evolutionarily conserved mechanism to modulate lipoprotein uptake.

 

[Ho Huu Tho]

#29.5
Idol Degrades the VLDLR and ApoER2
We have previously shown that the LXR-IDOL pathway targets the LDLR for degradation but not the related family members LRP1, SorLA, and LRP4 (13). Degradation by IDOL requires the presence of a highly conserved lysine residue that is adjacent to the NPVY endocytosis motif present in the intracellular domain of the LDLR (Fig. 3A). Because this residue is highly conserved in the VLDLR and ApoER2, we tested whether IDOL underlies the LXR-mediated reduction of these receptors. In co-transfection experiments in HEK 293 cells, we found that both human and mouse IDOL reduce the level of the VLDLR and ApoER2, in addition to LDLR (Fig. 3B). Introducing an inactivating point mutation in the IDOL RING domain (C387A) (13) abrogated the effect on these receptors. Consistent with our previous studies of LDLR degradation, the most prominent effect of Idol was observed on the level of the mature (fully glycosylated) VLDLR and ApoER2 proteins. We confirmed that LXR requires Idol to reduce the levels of these receptors by knocking down Idol expression. A 70% reduction in Idol expression resulted in an increased basal level of VLDLR in 3T3-VLDLR cells and largely abrogated the ability of activated LXR to reduce the level of this receptor (supplemental Fig. S2). Unexpectedly, IDOL did not reduce the level of LRP1b, as may have been predicted based on sequence homology (Fig. 3, A and B) or the level of another NPVY-containing receptor, the epidermal growth factor receptor (data not shown). Our results further indicate that the substrate specificities of IDOL and PCSK9 overlap, because previous studies have suggested that PCSK9 can also reduce the protein levels of VLDLR and ApoER2 (26, 27).

Idol gây thoái biến VLDLR và ApoER2
Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng con đường LXR-IDOL nhắm tới sự thoái biến LDLR nhưng không thoái biến các thành viên liên quan của họ là LRP1, SorLA và LRP4 (13). Sự thoái biến bởi IDOL đòi hỏi sự có mặt của axit amin lysin có tính bảo thủ cao là axit amin liền kề với motif nhập bào NPVY có mặt ở vùng nội bào của LDLR (Hình 3A). Bởi vì axit amin này có tính bảo thủ cao ở VLDLR và ApoER2 nên chúng tôi đã đánh giá liệu IDOL có là nguyên nhân của sự giảm những thụ cảm thể này thông qua LXR. Trong các thí nghiệm đồng chuyển nạp ở các tế bào HEK 293, chúng tôi đã thấy rằng cả IDOL của người và chuột đều làm giảm mức độ của VLDLR và ApoER2 bên cạnh LDLR (Hình 3B). Việc tạo ra một đột biến điểm gây bất hoạt ở domain RING của IDOL (C387A)(13) đã triệt tiêu hiệu ứng lên các thụ cảm thể này. Phù hợp với những nghiên cứu trước đây của chúng tôi về sự thoái biến LDLR, hiệu ứng nổi bật nhất của Idol được quan sát ở mức độ của VLDLR hoàn chỉnh (được đường hóa toàn bộ) và các protein ApoER2. Chúng tôi xác nhận rằng LXR cần đến Idol để làm giảm mức độ của các thụ cảm thể này bởi làm giảm biểu hiện của Idol. Biểu hiện của Idol giảm 70% đã dẫn đến tăng mức độ nền của VLDLR ở các tế bào 3T3-VLDLR và triệt tiêu phần lớn khả năng làm giảm mức độ thụ cảm thể này của LXR hoạt hóa (Hình bổ sung. S2). Ngạc nhiên là, IDOL đã không làm giảm mức độ của LRP1b giống như có thể được dự đoán dựa vào sự tương đồng về trình tự (Hình 3, A và B) hoặc mức độ của thụ cảm thể chứa NPVY khác, thụ cảm thể của yếu tố phát triển biểu mô (số liệu không được thể hiện). Xa hơn, các kết quả của chúng tôi còn chỉ ra rằng sự đặc hiệu cơ chất của IDOL và PCSK9 đan xen nhau, vì những nghiên cứu trước đây đã gợi ý rằng PCSK9 cũng có thể làm giảm mức độ protein của VLDLR và ApoER2.(26, 27)

FIGURE 3.
IDOL targets the LDLR, VLDLR, and ApoER2 for degradation and is evolutionarily conserved. A, alignment of the intracellular domains of the human (h) LDLR, human VLDLR, mouse (m) ApoER2, L. migratoria LpR (lmLpr), and mouse Lrp1b. The triangles represent the conserved lysine following the NPVY endocytic motif and the cysteine that is ubiquitinated in the LDLR (13). The ApoER2 sequence is cut because of space considerations. B–E, HEK 293T cells were co-transfected with the indicated plasmids, and the total cell lysates were analyzed by immunoblotting as indicated. WT, wild type; MT, mutant. The blots are representative of at least two independent experiments.

IDOL nhắm đến sự thoái hóa của LDLR, VLDLR và ApoER2 và có tính bảo thủ về mặt tiến hóa. A, Sự sắp xếp của các domain nội bào của LDLR người, VLDLR người, ApoER2 chuột, LpR của L. migratoria và Lrp1b của chuột nhắt. Các tam giác thể hiện axit amin lysin bảo thủ tiếp theo sau motif nhập bào NPVY và axit amin cysteine bị ubiquitin hóa ở LDLR (13). Trình tự của ApoER2 bị cắt bỏ vì lý do không gian trình bày. B-E, các tế bào HEK 293T được đồng chuyển nạp bằng các plasmid cho trước và các dịch đặc toàn thể của tế bào được phân tích bằng lai miễn dịch như đã chỉ ra. WT, chủng không đột biến; MT, đột biến. Các kết quả lai là đại diện cho ít nhất là hai thí nghiệm độc lập.

The intracellular domain of the LDLR is critical for IDOL-dependent degradation. We have previously found that a mutant LDLR lacking the intracellular domain is resistant to IDOL-mediated degradation (13). We show here that replacing the natural intracellular domain of APP, which is not targeted by IDOL, with that of the LDLR allowed IDOL to target the chimeric receptor for destruction (Fig. 3C). This result demonstrates that the intracellular domain is both necessary and sufficient to direct Idol-dependent degradation of plasma membrane proteins.

Domain nội bào của LDLR có vai trò không thể thiếu đối với sự thoái biến phụ thuộc vào IDOL. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng LDLR đột biến thiếu domain nội bào kháng lại sự thoái biến qua trung gian IDOL (13). Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng sự thay thế domain nội bào tự nhiên của APP, là domain không bị nhắm tới bởi IDOL, bằng domain của LDLR cho phép IDOL nhắm tới sự phá hủy thụ cảm thể ghép (Hình 3C). Kết quả này mô tả rằng domain nội bào là cần và đủ để dẫn đến sự thoái hóa phụ thuộc Idol của các protein màng bào tương.

The function of members of the LDLR family of receptors is evolutionarily conserved. Accordingly, we find that IDOL degrades the LpR, an ancient LDLR-related receptor from the migrating locust (Locusta migratoria) that is important for lipoprotein uptake in this species (Fig. 3, A and D) (25). We next asked the reciprocal question of whether the function of IDOL itself is evolutionarily conserved. We identified IDOL homologs in both vertebrate and nonvertebrate species (supplemental Fig. S3). The D. melanogaster Dnr1 gene is a distant homolog of mammalian IDOL (28). Remarkably, Dnr1 degraded the human LDLR and VLDLR dependent on an intact RING domain (Fig. 3E). Dnr1 is an inhibitor of the inflammatory IMD pathway in flies (28). However, despite the fact that both Dnr1 and IDOL degrade the LDLR and VLDLR, IDOL was unable to inhibit the IMD pathway in S2 cells (supplemental Fig. S4). In conclusion, these results suggest that the ability of IDOL to degrade members of the LDLR family is an evolutionarily conserved mechanism to modulate lipoprotein uptake.

Chức năng của các thành viên của họ thụ cảm thể LDLR có tính bảo thủ về mặt tiến hóa. Theo đó, chúng tôi thấy rằng IDOL gây thoái biến LpR, một thụ cảm thể cổ liên quan với LDLR ở châu chấu di cư (Locusta migratoria) là thụ cảm thể có vai trò quan trọng đối với hấp thu lipoprotein ở loài này (Hình 3, A và D) (25). Tiếp theo, chúng tôi đã đặt câu hỏi ngược lại là liệu chức năng của chính IDOL có bảo thủ về mặt tiến hóa không. Chúng tôi đã xác định các yếu tố tương đồng với IDOL ở cả các loài có và không có xương sống (Hình bổ sung S3). Gen Dnr1 của D. melanogaster là một yếu tố tương đồng xa của IDOL của động vật có vú (28). Ấn tượng là, Dnr1 làm thoái biến LDLR và VLDLR phụ thuộc vào domain RING toàn vẹn (Hình 3E). Dnr1 là yếu tố ức chế của con đường viêm IMD ở ruồi (28). Tuy nhiên, dù cho cả Dnr1 và IDOL đều làm thoái biến LDLR và VLDLR thì IDOL không thể ức chế con đường IMD ở các tế bào S2 (Hình bổ sung S4). Kết luận lại, những kết quả này gợi ý rằng khả năng của IDOL làm thoái biến các thành viện của họ LDLR là một cơ chế có tính bảo thủ về mặt tiến hóa để điều biến sự hấp thu lipoprotein.

 

[Ho Huu Tho]

#29.6
Post-translational Degradation of the VLDLR by Idol Activation of the LXR pathway leads to decreased levels of VLDLR and ApoER2 protein without an effect on the respective transcript (Fig. 1, A–C, and not shown). Adenoviral expression of Idol in SNB19 cells had a similar effect (Fig. 4A). These findings are consistent with a post-translational effect on receptor levels. Pulse-chase metabolic labeling experiments revealed that Idol did not impact the translation of the VLDLR (Fig. 4B). In the absence of Idol, the VLDLR rapidly matures as evidenced by the appearance of a lower mobility band representing the fully glycosylated receptor. Idol expression prevented the appearance of the mature form of the receptor, consistent with our prior observations with the LDLR.

FIGURE 4.
Post-translations regulation of the VLDLR by IDOL is dependent on ubiquitination of a single conserved lysine residue. A, adenovirally mediated expression of Idol in SNB19 cells leads to a decreased level of endogenous Vldlr. B, HEK 293T cells were co-transfected with a VLDLR and a control or Idol expression plasmid. 48 h after transfection cells were pulsed with [35S]methionine and [35S]cysteine for 15 min and chased as indicated. The samples were immunoprecipitated (IP) at the indicated time points after labeling. p and m represent the precursor and mature VLDLR protein, respectively. C, HEK 293T cells were co-transfected with VLDLR-GFP, Idol, and HA-ubiquitin expression plasmids as indicated. Subsequently, the cells were treated with vehicle or 25 μm MG132 for 6 h. D, HEK 293T cells were co-transfected with Idol and wild type or mutant VLDLR-HA expression plasmids. Total cell lysates were analyzed by immunoblotting (IB). The blots are representative of at least two independent experiments.

Because Idol is an E3 ubiquitin-ligase, we tested whether the VLDLR was ubiquitinated by Idol. In the presence of active Idol, we observed the appearance of polyubiquitinated VLDLR (Fig. 4C). Pharmacological blocking of the proteosome did not result in increased ubiquitination of the VLDLR and did not impair degradation of the receptor by Idol (Fig. 4C). Blocking lysosomal function with the lysosomotropic agents ammonium chloride or chloroquine, on the other hand, largely inhibited the LXR-mediated reduction of Vldlr abundance (supplemental Fig. S5). These observations are consistent with Idol-dependent lysosomal degradation of the VLDR as we recently proposed for the LDLR (13).
Having established that the VLDLR is subject to ubiquitination by Idol, we next attempted to identify the target residue(s). Mutation of all three lysine residues present in the intracellular tail of the VLDLR abolished degradation by Idol (Fig. 4D). Remarkably, mutating the highly conserved lysine residue immediately following the NPVY endocytotic motif resulted in the same outcome, indicating that this residue is the sole target for Idol-mediated ubiquitination. Note that the cysteine residue that serves as a second target for Idol in the LDLR is not conserved in either the VLDLR or ApoER2 (Fig. 3A).

 

[Ho Huu Tho]

#29.6
Post-translational Degradation of the VLDLR by Idol Activation of the LXR pathway leads to decreased levels of VLDLR and ApoER2 protein without an effect on the respective transcript (Fig. 1, A–C, and not shown). Adenoviral expression of Idol in SNB19 cells had a similar effect (Fig. 4A). These findings are consistent with a post-translational effect on receptor levels. Pulse-chase metabolic labeling experiments revealed that Idol did not impact the translation of the VLDLR (Fig. 4B). In the absence of Idol, the VLDLR rapidly matures as evidenced by the appearance of a lower mobility band representing the fully glycosylated receptor. Idol expression prevented the appearance of the mature form of the receptor, consistent with our prior observations with the LDLR.

Sự thoái biến sau dịch mã của VLDLR bởi Idol. Sự hoạt hóa của con đường LXR dẫn đến giảm mức độ protein VLDLR và ApoER2 mà không ảnh hưởng đến ARN tương ứng (Hình 1, A-C và phần không được trình bày). Biểu hiện Idol của vi rút adeno ở các tế bào SNB19 có một hiệu ứng tương tự (Hình 4A). Những kết quả này phù hợp với hiệu ứng sau dịch mã lên mức độ thụ cảm thể. Các thí nghiệm đánh dấu chuyển hóa kiểu xung - đuổi cho thấy rằng Idol không ảnh hưởng đến sự dịch mã của VLDLR (Hình 4B). Khi không có mặt Idol, VLDLR nhanh chóng hoàn thiện được xác nhận bởi sự xuất hiện băng di chuyển chậm của thụ cảm thể được đường hóa toàn bộ. Biểu hiện của Idol đã ngăn cản sự xuất hiện dạng hoàn chỉnh của thụ cảm thể, phù hợp với các quan sát trước đây của chúng tôi đối với LDLR.

FIGURE 4.
Post-translations regulation of the VLDLR by IDOL is dependent on ubiquitination of a single conserved lysine residue. A, adenovirally mediated expression of Idol in SNB19 cells leads to a decreased level of endogenous Vldlr. B, HEK 293T cells were co-transfected with a VLDLR and a control or Idol expression plasmid. 48 h after transfection cells were pulsed with [35S]methionine and [35S]cysteine for 15 min and chased as indicated. The samples were immunoprecipitated (IP) at the indicated time points after labeling. p and m represent the precursor and mature VLDLR protein, respectively. C, HEK 293T cells were co-transfected with VLDLR-GFP, Idol, and HA-ubiquitin expression plasmids as indicated. Subsequently, the cells were treated with vehicle or 25 μm MG132 for 6 h. D, HEK 293T cells were co-transfected with Idol and wild type or mutant VLDLR-HA expression plasmids. Total cell lysates were analyzed by immunoblotting (IB). The blots are representative of at least two independent experiments.

HÌNH 4.
Sự điều hòa sau dịch mã của VLDLR bởi IDOL phụ thuộc vào sự ubiquitin hóa của axit amin lysine bảo thủ đơn lẻ. A, Biểu hiện của Idol qua trung gian vi rút adeno ở các tế bào SNB dẫn đến giảm mức độ Vldlr nội sinh. B, Các tế bào HEK 293T được đồng chuyển nạp plasmid biểu hiện VLDLR và chứng hay Idol. 48 h sau chuyển nạp, các tế bào được nhận xung bằng [35S]methionine và [35S]cysteine trong thời gian 15 phút và đuổi như đã được chỉ ra. Các mẫu được ngưng kết miễn dịch (IP) tại thời điểm được chỉ định sau đánh dấu. p và m lần lượt đại diện cho protein VLDLR tiền thân và trưởng thành. C, Các tế bào HEK 293T được đồng chuyển nạp với plasmid biểu hiện VLDLR-GFP, Idol và HA-ubiquitin như đã chỉ ra. Sau đó, các tế bào được xử lý với tá dược hay 25 μm MG132 trong 6 h. D, Các tế bào HEK 293T được đồng chuyển nạp với các plasmid biểu hiện Idol và VLDLR-HA không đột biến hay đột biến. Dịch đặc toàn thể của tế bào được phân tích bằng lai miễn dịch (IB). Các kết quả lai đại diện cho ít nhất hai thí nghiệm độc lập.

Because Idol is an E3 ubiquitin-ligase, we tested whether the VLDLR was ubiquitinated by Idol. In the presence of active Idol, we observed the appearance of polyubiquitinated VLDLR (Fig. 4C). Pharmacological blocking of the proteosome did not result in increased ubiquitination of the VLDLR and did not impair degradation of the receptor by Idol (Fig. 4C). Blocking lysosomal function with the lysosomotropic agents ammonium chloride or chloroquine, on the other hand, largely inhibited the LXR-mediated reduction of Vldlr abundance (supplemental Fig. S5). These observations are consistent with Idol-dependent lysosomal degradation of the VLDR as we recently proposed for the LDLR (13).
Having established that the VLDLR is subject to ubiquitination by Idol, we next attempted to identify the target residue(s). Mutation of all three lysine residues present in the intracellular tail of the VLDLR abolished degradation by Idol (Fig. 4D). Remarkably, mutating the highly conserved lysine residue immediately following the NPVY endocytotic motif resulted in the same outcome, indicating that this residue is the sole target for Idol-mediated ubiquitination. Note that the cysteine residue that serves as a second target for Idol in the LDLR is not conserved in either the VLDLR or ApoER2 (Fig. 3A).

Vì Idol là một ubiquitin-ligase E3 nên chúng tôi đã đánh giá xem liệu VLDLR có bị ubiquitin hóa bởi Idol hay không. Khi có mặt Idol hoạt hóa, chúng tôi đã quan sát thấy sự xuất hiện của VLDLR được poly ubiquitin hóa (Hình 4C). Ngăn chặn dược lý hệ thống phân hủy protein (proteosome) không làm tăng ubiquitin hóa của VLDLR và không làm suy yếu sự thoái biến của thụ cảm thể bởi Idol (Hình 4C). Ngược lại, ngăn chặn chức năng của lysosome bằng các tác nhân hướng lysosome amoni chlorua hay chloroquine lại ức chế phần lớn sự giảm mức độ Vldlr qua trung gian LXR (Hình bổ sung S5). Những quan sát này phù hợp với sự thoái biến ở lysosome phụ thuộc Idol của VLDR mà chúng tối đã đề xuất gần đây đối với LDLR (13).
Sau khi thiết lập rằng VLDLR là đối tượng của sự ubiquitin hóa bởi Idol, chúng tôi tiếp tục nỗ lực xác định (các) axit amin đích. Đột biến ở cả ba axit amin lysine có mặt ở đuôi phía bên trong tế bào của VLDLR làm mất đi sự thoái biến bởi Idol (Hình 4D). Ấn tượng là, gây đột biến axit amin lysin có tính bảo thủ cao tiếp ngay sau motif nhập bào NPVY cho ra một kết cục tương tự, điều này chỉ ra rằng axit amin này là đích duy nhất của sự ubiquitin hóa qua trung gian Idol. Lưu ý rằng axit amin cysteine đóng vai trò nhừ một đích thứ cấp của Idol ở LDLR không có tính bảo thủ ở cả VLDLR hay ApoER2 (Hình 3A)

 

[Ho Huu Tho]

#29.7
The LXR-IDOL Axis Reduces Reelin Binding and Dab1 Phosphorylation
In addition to their proposed roles in metabolism, the VLDLR and ApoER2 are critical for neuronal migration during development (16, 20, 21). We therefore asked whether the LXR-IDOL pathway was functional in neurons. Treatment of primary rat neurons with an LXR ligand increased the mRNA and protein levels of Abca1 and Idol, whereas expression of Vldlr did not change (Fig. 5A). Given the fact that it is an unstable protein, detection of endogenous Idol expression has been difficult (13). Interestingly, this is the first observation that activation of LXR increases the level of endogenous Idol protein. Several isoforms of the VLDLR have been observed in neurons (26, 29). We found that the isoform lacking the O-linked glycosylation domain, which runs with higher mobility in these cells, was most dramatically decreased in response to LXR activation (Fig. 5B and supplemental Fig. S6). Notably, this is similar to what was observed for Pcsk9 (26).

FIGURE 5.
Functional cross-talk between the LXR pathway and Reelin signaling. A, gene expression analysis of primary rat hippocampal neurons treated with 1 μm GW3965 (GW) ligand for 24 h. The fold change in mRNA expression following GW treatment is plotted. Expression of the indicated genes in dimethyl sulfoxide-treated cells (DMSO) was set to 1 (nB, immunoblot analysis of primary rat hippocampal neurons treated with 1 μm GW ligand for 24 h. The arrow indicates the Vldlr isoform that is modulated by LXR treatment (n = 4–6). C, SNB19 cells were treated with 1 μm of the indicated LXR ligands or dimethyl sulfoxide for 24 h. Subsequently, binding of Reelin to the cells and the level of the indicated proteins were determined by immunoblotting (n = 3). D, NIH 3T3 cells that stably produce Dab1 and VLDLR (3T3V/D) or ApoER2 (3T3A/D) were treated with or without 1 μm GW and Reelin or mock conditioned media as indicated. The level of total Dab1 and phospho-Dab1 were determined by immunoblotting. The blots are representative of at least two independent experiments. The bars and error bars represent the means ± S.D. **, p < 0.01; ***, p < 0.001. T0, T0901317. = 4–6).

An expected consequence of reduced VLDLR expression in neurons would be decreased Reelin binding and signaling. We initially chose SNB19 cells as a cellular model to test this possibility. Activation of the LXR pathway in these cells with the two different ligands GW3965 and T0901317 decreased the level of the VLDLR to 26 ± 4 or 22 ± 8% of the control treated cells, respectively (Fig. 5C). Furthermore, this was mirrored by a decrease in Reelin binding. To test whether this also led to decreased Dab1 phosphorylation, we used 3T3 cells that had been stably reconstituted with VLDLR or ApoER2 and with Dab1 (22). Functionally, these cells responded to Reelin in a similar fashion to primary neurons, with Reelin binding strongly stimulating Dab1 phosphorylation (Fig. 5D). Activation of LXR in these cells largely blocked this Reelin-dependent effect but had no influence on total Dab1 levels (Fig. 5D). Thus, the ability of LXR to modulate the levels of the neuronal lipoprotein receptors VLDLR and ApoER2 appears to have a functional consequence for Reelin signaling.

 

[Ho Huu Tho]

#29.7
The LXR-IDOL Axis Reduces Reelin Binding and Dab1 Phosphorylation
In addition to their proposed roles in metabolism, the VLDLR and ApoER2 are critical for neuronal migration during development (16, 20, 21). We therefore asked whether the LXR-IDOL pathway was functional in neurons. Treatment of primary rat neurons with an LXR ligand increased the mRNA and protein levels of Abca1 and Idol, whereas expression of Vldlr did not change (Fig. 5A). Given the fact that it is an unstable protein, detection of endogenous Idol expression has been difficult (13). Interestingly, this is the first observation that activation of LXR increases the level of endogenous Idol protein. Several isoforms of the VLDLR have been observed in neurons (26, 29). We found that the isoform lacking the O-linked glycosylation domain, which runs with higher mobility in these cells, was most dramatically decreased in response to LXR activation (Fig. 5B and supplemental Fig. S6). Notably, this is similar to what was observed for Pcsk9 (26).

Trục LXR-IDOL làm giảm sự gắn của Reelin và phosphoryl hóa của Dab1.
Bên cạnh vai trò đã được đề cập của chúng trong chuyển hóa thì VLDLR và ApoER2 còn có vai trò không thể thiếu đối với sự di chuyển của tế bào thần kinh trong quá trình phát triển (16, 20, 21). Bởi thế, chúng tôi đặt câu hỏi liệu con đường LXR-IDOL có hoạt động ở các tế bào thần kinh hay không. Xử lý các tế bào thần kinh chính của chuột cống bằng phối tử LXR làm tăng mức độ mRNA và protein của Abca1 và Idol, trong khi đó biểu hiện của Vldlr không thay đổi (Hình 5A). Vì trong thực tế nó là một protein không bền nên việc phát hiện biểu hiện của Idol nội sinh gặp khó khăn (13). Thật thú vị khi đây là quan sát đầu tiên về sự hoạt hóa của LXR làm gia tăng mức độ của protein Idol nội sinh. Một vài đồng phân của VLDLR đã được quan sát ở các tế bào thần kinh (26, 29). Chúng tôi thấy rằng đồng phân thiếu domain đường hóa gắn với Oxy, là đồng phân chạy với tốc độ nhanh hơn ở các tế bào này, bị giảm mạnh nhất khi đáp ứng lại sự hoạt hóa của LXR (Hình 5B và Hình bổ sung S6). Lưu ý rằng, điều này tương tự với hiện tượng đã được quan sát với Pcsk9 (26).

FIGURE 5.
Functional cross-talk between the LXR pathway and Reelin signaling. A, gene expression analysis of primary rat hippocampal neurons treated with 1 μm GW3965 (GW) ligand for 24 h. The fold change in mRNA expression following GW treatment is plotted. Expression of the indicated genes in dimethyl sulfoxide-treated cells (DMSO) was set to 1 (n= 4–6). B, immunoblot analysis of primary rat hippocampal neurons treated with 1 μm GW ligand for 24 h. The arrow indicates the Vldlr isoform that is modulated by LXR treatment (n = 4–6). C, SNB19 cells were treated with 1 μm of the indicated LXR ligands or dimethyl sulfoxide for 24 h. Subsequently, binding of Reelin to the cells and the level of the indicated proteins were determined by immunoblotting (n = 3). D, NIH 3T3 cells that stably produce Dab1 and VLDLR (3T3V/D) or ApoER2 (3T3A/D) were treated with or without 1 μm GW and Reelin or mock conditioned media as indicated. The level of total Dab1 and phospho-Dab1 were determined by immunoblotting. The blots are representative of at least two independent experiments. The bars and error bars represent the means ± S.D. **, p < 0.01; ***, p < 0.001. T0, T0901317.

HÌNH 5.
Sự giao thoa chức năng giữa con đường LXR và tín hiệu Reelin. A, phân tích biểu hiện gen của tế bào thần kinh chính ở hồi hải mã chuột cống được xử lý với phối tử GW3965 (GW) 1 μm trong 24h. Sự thay đổi về số lần của biểu hiện mRNA sau khi xử lý bằng GW3965 (GW) được biểu đồ hóa. Biểu hiện của các gen quan tâm ở các tế bào được xử lý bằng dimethyl sulfoxide (DMSO) được coi là 1 (n= 4–6). B, phân tích lai miễn dịch của các tế bào thần kinh chính hồi hải mã chuột cống được xử lý bằng phối tử GW3965 (GW) 1 μm trong 24h. Mũi tên chỉ đồng phân Vldlr là đồng phân được điều biến nhờ xử lý của LXR (n = 4-6). C, Các tế bào SNB19 được xử lý với 1 μm phối tử được chỉ định của LXR hay dimethyl sulfoxide trong 24h. Sau đó, sự gắn của Reelin vào các tế bào và mức độ của protein được chỉ ra được xác định bằng lai miễn dich (n = 3). D, Các tế bào NIH 3T3, là tế bào tổng hợp ổn định Dab1 và VLDLR (3T3V/D) hay ApoER2 (3T3A/D), được xử lý với sự có mặt hoặc không có mặt 1 μm GW và Reelin hay môi trường đối chứng đã qua nuôi cấy như được chỉ ra. Mức độ của Dab1 tổng số và Dab1 phosphoryl hóa được xác định bằng lai miễn dịch. Kết quả lai đại diện cho ít nhất hai thí nghiệm độc lập. Các cột và cột sai số đại diện cho số trung bình ± S.D. **, p < 0.01; ***, p < 0.001. T0, T0901317.

An expected consequence of reduced VLDLR expression in neurons would be decreased Reelin binding and signaling. We initially chose SNB19 cells as a cellular model to test this possibility. Activation of the LXR pathway in these cells with the two different ligands GW3965 and T0901317 decreased the level of the VLDLR to 26 ± 4 or 22 ± 8% of the control treated cells, respectively (Fig. 5C). Furthermore, this was mirrored by a decrease in Reelin binding. To test whether this also led to decreased Dab1 phosphorylation, we used 3T3 cells that had been stably reconstituted with VLDLR or ApoER2 and with Dab1 (22). Functionally, these cells responded to Reelin in a similar fashion to primary neurons, with Reelin binding strongly stimulating Dab1 phosphorylation (Fig. 5D). Activation of LXR in these cells largely blocked this Reelin-dependent effect but had no influence on total Dab1 levels (Fig. 5D). Thus, the ability of LXR to modulate the levels of the neuronal lipoprotein receptors VLDLR and ApoER2 appears to have a functional consequence for Reelin signaling.

Một hệ quả được dự đoán của giảm biểu hiện VLDLR ở các tế bào thần kinh có thể là giảm sự gắn và tín hiệu Reelin. Ban đầu, chúng tôi chọn các tế bào SNB19 để làm mô hình tế bào nhằm đánh giá khả năng này. Hoạt hóa con đường LXR ở các tế bào này với hai phối tử khác nhau GW3965 và T0901317 đã làm giảm mức độ của VLDLR lần lượt xuống còn 26 ± 4 hay 22 ± 8% so với các tế bào đối chứng được xử lý (Hình 5C). Hơn nữa, điều này được phản ánh qua sự giảm sự gắn của Reelin. Để đánh giá liệu điều này còn dẫn tới giảm phosphoryl hóa của Dab1 hay không, chúng tôi đã sử dụng các tế bào 3T3, đây là các tế bào đã được tái cấu trúc một cách ổn định với VLDLR hay ApoER2 và với Dab1 (22). Về mặt chức năng, các tế bào này đã đáp ứng lại Reelin theo cách tương tự với các tế bào thần kinh chính với việc gắn Reelin gây kích thích mạnh sự phosphoryl hóa Dab1 (Hình 5D). Sự hoạt hóa LXR ở những tế bào này ngăn chặn phần lớn hiệu ứng phụ thuộc vào Reelin này nhưng không ảnh hưởng tới mức độ Dab1 tổng số (Hình 5D). Bởi vậy, khả năng của LXR điều biến mức độ của các thụ cảm thể lipoprotein VLDLR và ApoER2 ở các tế bào thần kinh có vẻ có hệ quả chức năng đối với tín hiệu Reelin.

 

[Ho Huu Tho]

#29.8
DISCUSSION
In this study we demonstrate that, in addition to modulating the LDLR, the LXR pathway also post-translationally regulates the levels of the related receptors VLDLR and ApoER2. Mechanistically, this is the result of transcriptional induction of the E3 ubiquitin ligase IDOL that targets these receptors for lysosomal degradation. The ability of the LXR-IDOL pathway to target multiple members of the LDLR superfamily suggests a potential role for this pathway in processes beyond lipid metabolism.
Over the last decade the role of LXR in peripheral cholesterol and energy metabolism has been the subject of considerable research interest (30). However, it has recently become apparent that LXRs also play important roles in maintaining cholesterol homeostasis and attenuating inflammatory events in the CNS. Accordingly, the LXR pathway in the CNS has been proposed to be a potential target for treatment of Alzheimer disease (31,–33), Nieman-Pick C (34), and ischemic events (35, 36). Our current study extends the possible roles for LXR in the CNS. IDOL is expressed in neurons and is induced by LXR agonists in these cells both at the mRNA and protein levels. In these cells IDOL has been proposed to inhibit neurite outgrowth (37) and, as we show here, to modulate the Reelin pathway by controlling the levels of VLDLR and ApoER2. Reelin interaction with the VLDLR and ApoER2 is critical during development because it properly directs the positioning of neurons (16, 20, 21). Because only the combined loss of both receptors results in severely impaired neuronal positioning (16), the ability of IDOL to simultaneously target both receptors for degradation may allow it to modulate this pathway. Whether IDOL does this in vivo is unknown. Intriguingly, despite having a similar Reelin level, mice lacking LXR display disrupted neuronal migration, which Fan et al. (38) attributed to a reduction in the number of vertical processes emanating from the radial glia cells. Because the formation of vertical processes emanating from these cells requires proper Reelin signaling (39) and the LXR null mice have substantially reduced Idol expression (13), it remains to be seen whether Idol contributes to the observed migratory defect. Furthermore, the phosphorylation of Dab1 downstream of the VLDLR and ApoER2 is not limited to the CNS. In macrophages, ligation of ApoER2 by activated protein C results in Dab1-dependent signaling events (40). This raises the possibility that the LXR-IDOL pathway may be involved not only in Reelin signaling in the CNS but also in peripheral Dab1-dependent processes.
Our investigation of the substrate specificity of IDOL was largely prompted by the high degree of evolutionary conservation within the LDLR family of receptors (14). Of the mammalian members tested, only the LDLR, VLDLR, and ApoER2 appear to be IDOL targets. Remarkably, IDOL was also able to degrade an ancient LDLR family member important for lipoprotein uptake in the migrating locust. IDOL itself is also highly evolutionarily conserved, with homologs found in both vertebrates and nonvertebrates. The D. melanogaster Dnr1 gene is a highly divergent homolog of mammalian IDOL (28). Nevertheless, Dnr1 degraded the LDLR and VLDLR in co-transfection assays in a RING-dependent manner. Dnr1 has been reported to inhibit the IMD pathway in flies. This pathway is important for the innate response to Gram-negative bacteria in flies and shares similarities with the mammalian tumor necrosis factor cascade. Dnr1 inhibits the IMD pathway by blocking the activity of the fly caspases-8 homolog, Dredd (41). However, our data indicate that IDOL was unable to attenuate the IMD pathway when stably expressed in S2 macrophage-like cells, suggesting that this capacity has been lost during evolution. A plausible explanation for this lies in the fact that the region in Dnr1 identified as crucial for interaction with Dredd is absent in IDOL (41).
The delineated substrate specificity allows us to also further define the structural requirements for receptor recognition by IDOL. The intracellular domain of the LDLR forms a scaffold for protein-protein interactions essential for proper function and trafficking of the receptor (42). Furthermore, this domain is both required and sufficient for recognition by IDOL. This implies that all of the IDOL recognition determinants are encoded within this region. Sequence comparison of the receptors targeted by IDOL reveals that a limited region surrounding the NPVY endocytosis motif is highly conserved. The lysine residue following this motif is essential for ubiquitination by IDOL (Ref. 13 and Fig. 4D). However, its presence is not sufficient, because LRP1b is not targeted by IDOL. Future identification of the putative IDOL/receptor interaction interface may facilitate development of structure-based inhibitors aimed specifically at disrupting the IDOL-LDLR association. Such inhibitors would be predicted to increase the level of the LDLR and may complement statins for treating hypercholesterolemia.
Similar to IDOL, the secreted protein PCSK9 also post-translationally modulates the levels of the LDLR, VLDLR, and ApoER2 (26, 27). The overlapping substrate specificities of IDOL and PCSK9 raise the intriguing possibility that they act in a concerted fashion. It is highly unlikely that these two proteins directly interact. PCSK9 is a secreted protein that binds the ecto-domain of the receptors and promotes their endocytosis and lysosomal degradation. It has also been recently proposed that PCSK9 can act on the LDLR within the cell (43). IDOL, on the other hand, recognizes the intracellular tail of these receptors. It remains to be seen whether these two proteins functionally cooperate to regulate the level of these receptors and, if so, whether this occurs during their maturation or subsequent to their endocytosis. Of note, under several conditions the activity of IDOL on the LDLR seems to be independent of PCSK9. IDOL degrades the LDLR in cells that do not express PCSK9 (e.g. macrophages) as well as endocytosis mutants of the LDLR, VLDLR, and ApoER2. Clearly, further studies to clarify the functional relationship between PCSK9 and IDOL are required.
In conclusion, we demonstrate here that the LXR-IDOL pathway targets the VLDLR and ApoER2 for degradation. This suggests that in addition to potential roles in metabolism, IDOL may also have a role in neurons during development.

 

[Ho Huu Tho]

#29.8
DISCUSSION
In this study we demonstrate that, in addition to modulating the LDLR, the LXR pathway also post-translationally regulates the levels of the related receptors VLDLR and ApoER2. Mechanistically, this is the result of transcriptional induction of the E3 ubiquitin ligase IDOL that targets these receptors for lysosomal degradation. The ability of the LXR-IDOL pathway to target multiple members of the LDLR superfamily suggests a potential role for this pathway in processes beyond lipid metabolism.

Trong nghiên cứu này chúng tôi mô tả rằng bên cạnh điều biến LDLR thì con đường LXR còn điều hòa sau dịch mã mức độ của các thụ cảm thể liên quan là VLDLR và ApoER2. Về mặt cơ chế, điều này là kết quả của sự tăng cường phiên mã của ubiquitin ligase E3 IDOL, đây là yếu tố định hướng cho những thụ cảm thể này bị thoái biến ở lysosome. Khả năng của con đường LXR-IDOL nhắm tới nhiều thành viên của siêu họ LDLR gợi ý vai trò tiềm năng của con đường này trong các quá trình đằng sau sự chuyển hóa lipid.

Over the last decade the role of LXR in peripheral cholesterol and energy metabolism has been the subject of considerable research interest (30). However, it has recently become apparent that LXRs also play important roles in maintaining cholesterol homeostasis and attenuating inflammatory events in the CNS. Accordingly, the LXR pathway in the CNS has been proposed to be a potential target for treatment of Alzheimer disease (31,–33), Nieman-Pick C (34), and ischemic events (35, 36). Our current study extends the possible roles for LXR in the CNS. IDOL is expressed in neurons and is induced by LXR agonists in these cells both at the mRNA and protein levels. In these cells IDOL has been proposed to inhibit neurite outgrowth (37) and, as we show here, to modulate the Reelin pathway by controlling the levels of VLDLR and ApoER2. Reelin interaction with the VLDLR and ApoER2 is critical during development because it properly directs the positioning of neurons (16, 20, 21). Because only the combined loss of both receptors results in severely impaired neuronal positioning (16), the ability of IDOL to simultaneously target both receptors for degradation may allow it to modulate this pathway. Whether IDOL does this in vivo is unknown. Intriguingly, despite having a similar Reelin level, mice lacking LXR display disrupted neuronal migration, which Fan et al. (38) attributed to a reduction in the number of vertical processes emanating from the radial glia cells. Because the formation of vertical processes emanating from these cells requires proper Reelin signaling (39) and the LXR null mice have substantially reduced Idol expression (13), it remains to be seen whether Idol contributes to the observed migratory defect. Furthermore, the phosphorylation of Dab1 downstream of the VLDLR and ApoER2 is not limited to the CNS. In macrophages, ligation of ApoER2 by activated protein C results in Dab1-dependent signaling events (40). This raises the possibility that the LXR-IDOL pathway may be involved not only in Reelin signaling in the CNS but also in peripheral Dab1-dependent processes.

Trong suốt thập kỷ qua, vai trò của LXR đối với cholesterol ngoại vi và chuyển hóa năng lượng là chủ đề thu hút sự quan tâm nghiên cứu (30). Tuy nhiên gần đây, nó đã trở nên rõ ràng là các LXR còn giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự hằng định cholesterol và làm giảm các hiện tượng viêm ở hệ thần kinh trung ương. Theo đó, con đường LXR ở hệ thần kinh trung ương đã được đề xuất là một đích tiềm năng để điều trị bệnh Alzheimer (31,-33), Nieman-Pick C (34) và các sự kiện thiếu máu cục bộ (35, 36). Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi mở rộng các vai trò có thể của LXR đối với hệ thần kinh trung ương. IDOL được biểu hiện ở các tế bào thần kinh và được tăng cường bởi các yếu tố đồng vận LXR ở các tế bào này cả ở mức độ mRNA và protein. Trong các tế bào này, IDOL đã được đề xuất là ức chế sự đâm chồi các dây thần kinh (37) và như chúng tôi chỉ ra ở đây, IDOL điều biến con đường Reelin bằng cách điều khiển mức độ của VLDLR và ApoER2. Sự tương tác của Reelin với VLDLR và ApoER2 có vai trò không thể thiếu trong suốt quá trình phát triển bởi vì nó điều khiển một cách chính xác sự định vị của các tế bào thần kinh (16, 20, 21). Bởi vì chỉ khi mất đồng thời cả hai thụ cảm thể mới dẫn đến sự định vị bị sai lệch nghiêm trọng của các tế bào thần kinh (16), nên khả năng của IDOL để hướng đồng thời cả hai thụ cảm thể cho sự thoái hóa có thể cho phép nó điều biến con đường này. IDOL có thực hiện điều này ở mức độ in vivo hay không thì vẫn chưa được biết. Thú vị là mặc dù có mức độ Reelin tương tự, nhưng chuột nhắt thiếu LXR thể hiện sự di chuyển bị gián đoạn của tế bào thần kinh mà Fan và cộng sự (38) đã quy cho sự giảm số lượng các sợi thẳng đứng mọc ra từ các tế bào glia lan tỏa. Bởi vì sự hình thành của các sợi thẳng đứng mọc ra từ các tế bào này cần đến tín hiệu Reelin chuẩn xác (39) và chuột nhắt chuyển gen thiếu LXR đã giảm phần lớn biểu hiện của Idol (13), nên vẫn cần biết liệu Idol có đóng góp vào sự sai sót di chuyển đã được quan sát. Hơn nữa, sự phosphoryl hóa của Dab1 xuôi dòng của thụ cảm thể VLDLR và ApoER2 không giới hạn ở hệ thần kinh trung ương. Ở đại thực bào, sự gắn của ApoER2 bởi protein C hoạt hóa dẫn đến các sự kiện tín hiệu phụ thuộc Dab1 (40). Điều này đặt ra khả năng là con đường LXR-IDOL có thể không chỉ liên quan đến tín hiệu Reelin ở hệ thần kinh trung ương mà còn liên quan đến các quá trình ngoại vi phụ thuộc Dab1.

Our investigation of the substrate specificity of IDOL was largely prompted by the high degree of evolutionary conservation within the LDLR family of receptors (14). Of the mammalian members tested, only the LDLR, VLDLR, and ApoER2 appear to be IDOL targets. Remarkably, IDOL was also able to degrade an ancient LDLR family member important for lipoprotein uptake in the migrating locust. IDOL itself is also highly evolutionarily conserved, with homologs found in both vertebrates and nonvertebrates. The D. melanogaster Dnr1 gene is a highly divergent homolog of mammalian IDOL (28). Nevertheless, Dnr1 degraded the LDLR and VLDLR in co-transfection assays in a RING-dependent manner. Dnr1 has been reported to inhibit the IMD pathway in flies. This pathway is important for the innate response to Gram-negative bacteria in flies and shares similarities with the mammalian tumor necrosis factor cascade. Dnr1 inhibits the IMD pathway by blocking the activity of the fly caspases-8 homolog, Dredd (41). However, our data indicate that IDOL was unable to attenuate the IMD pathway when stably expressed in S2 macrophage-like cells, suggesting that this capacity has been lost during evolution. A plausible explanation for this lies in the fact that the region in Dnr1 identified as crucial for interaction with Dredd is absent in IDOL (41).

Nghiên cứu của chúng tôi về sự đặc hiệu cơ chất của IDOL chủ yếu được thúc đẩy bởi mức độ bảo thủ tiến hóa cao ở họ các thụ cảm thể LDLR (14). Ở các động vật có vú đã được đánh giá thì chỉ có LDLR, VLDLR và ApoER2 có vẻ là các đích của IDOL. Ấn tượng là, IDOL cũng có thể thoái hóa một thành viên họ LDLR cổ có vai trò quan trọng đối với hấp thu lipoprotein ở châu chấu di cư. Bản thân IDOL cũng có tính bảo thủ cao về mặt tiến hóa với các đồng phân được tìm thấy ở cả động vật có xương sống và động vật không xương sống. Gen Dnr1 của D. melanogaster là một đồng phân biến thiên cao độ của IDOL ở động vật có vú (28). Tuy nhiên, Dnr1 làm thoái biến LDLR và VLDLR ở thử nghiệm đồng chuyển nạp theo cách thức phụ thuộc RING. Dnr1 đã được báo cáo là ức chế con đường IMD ở ruồi. Con đường này quan trọng cho đáp ứng tự nhiên đối với vi khuẩn gram âm ở ruồi và có chung sự tương đồng với tầng yếu tố hoại tử u của động vật có vú. Dnr1 ức chế con đương IMD bằng cách ngăn chặn hoạt động của đồng phân caspases-8 ở ruồi là Dredd (41). Tuy nhiên, dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng IDOL không thể làm giảm con đường IMD khi được biểu hiện ổn định trong các tế bào dạng đại thực bào S2, và gợi ý rằng khả năng này đã bị mất qua quá trình tiến hóa. Sự lý giải khả dĩ cho điều này nằm ở thực tế là vùng nằm trên Dnr1 mà được xác định là thiết yếu cho sự tương tác với Dredd thì không có mặt ở IDOL (41).

The delineated substrate specificity allows us to also further define the structural requirements for receptor recognition by IDOL. The intracellular domain of the LDLR forms a scaffold for protein-protein interactions essential for proper function and trafficking of the receptor (42). Furthermore, this domain is both required and sufficient for recognition by IDOL. This implies that all of the IDOL recognition determinants are encoded within this region. Sequence comparison of the receptors targeted by IDOL reveals that a limited region surrounding the NPVY endocytosis motif is highly conserved. The lysine residue following this motif is essential for ubiquitination by IDOL (Ref. 13 and Fig. 4D). However, its presence is not sufficient, because LRP1b is not targeted by IDOL. Future identification of the putative IDOL/receptor interaction interface may facilitate development of structure-based inhibitors aimed specifically at disrupting the IDOL-LDLR association. Such inhibitors would be predicted to increase the level of the LDLR and may complement statins for treating hypercholesterolemia.

Similar to IDOL, the secreted protein PCSK9 also post-translationally modulates the levels of the LDLR, VLDLR, and ApoER2 (26, 27). The overlapping substrate specificities of IDOL and PCSK9 raise the intriguing possibility that they act in a concerted fashion. It is highly unlikely that these two proteins directly interact. PCSK9 is a secreted protein that binds the ecto-domain of the receptors and promotes their endocytosis and lysosomal degradation. It has also been recently proposed that PCSK9 can act on the LDLR within the cell (43). IDOL, on the other hand, recognizes the intracellular tail of these receptors. It remains to be seen whether these two proteins functionally cooperate to regulate the level of these receptors and, if so, whether this occurs during their maturation or subsequent to their endocytosis. Of note, under several conditions the activity of IDOL on the LDLR seems to be independent of PCSK9. IDOL degrades the LDLR in cells that do not express PCSK9 (e.g. macrophages) as well as endocytosis mutants of the LDLR, VLDLR, and ApoER2. Clearly, further studies to clarify the functional relationship between PCSK9 and IDOL are required.

In conclusion, we demonstrate here that the LXR-IDOL pathway targets the VLDLR and ApoER2 for degradation. This suggests that in addition to potential roles in metabolism, IDOL may also have a role in neurons during development.