Băn khoăn giữa hai pp Immunoprecipitate và Western blott

[Thành viên cũ]

Băn khoăn giữa hai pp Immunoprecipitate và Western blot

Chào các bạn,
Tôi mới bắt đầu bước vào lĩnh vực sinh học phân tử. Có một vài băn khoăn muốn hỏi các anh chị đi trước biết nhiều. Khi làm thực nghiệm tôi phải dùng 2 phương pháp là Immunoprecipitate và Western blott. Hai phương pháp này cũng gần giống nhau. Vậy tôi muốn hỏi là:

Khi nào thì dùng phương pháp Immunoprecipitate, khi nào thì dùng phương pháp Western blott. Hai phương pháp này có thể thay thế cho nhau được không. Khi nào thì chỉ dùng được hoặc Immunoprecipitate hoặc Western blott.

Xin cám ơn và chúc cho Diễn đàn ngày càng phát triển.

Bean

 

[Trần Hoàng Dũng]

Tôi ?nhớ kô lầm thì:

- immuneprecipitate dùng để làm việc với các mẫu mô tế bào trực tiếp, tức là bạn có mẫu mô tb làm sinh thiết, trãi lên lam, ok, dùng pp immunoprecipitate để tìm marker thông qua các kháng thể đã biết.

- Western blot thì ngược lại, ta tách hỗn hợp protein, cho chạy điện di rồi mới thả kháng thể vô.

Nhờ anh chị em khác giúp thêm.

 

[Trương Quốc Phong]

Phân biệt IP và WB:
Về cơ chế thì có thể nói là giống nhau, vì nó đều dựa vào phản ứng KN-KT. Nhưng do Mục đích của 2 phương pháp là khác nhau nên quy trình tiến hành thí nghiệm hoàn toàn khác nhau:
* Về IP:
- Mục đích là tách một hoặc một số protein quan tâm ra khỏi hỗn hợp protein (total protein hoặc crude extract) dựa vào Khả năng liên kết đặc hiệu của protein quan tâm với KT đặc hiệu của chúng. Phương pháp cũng tương tự như Sắc ký ái lực.
- Người ta gọi phương pháp này là phương pháp phân tách protein không dựa vào gel ( free gel analysis ).
- Tại sao người ta lại sử dụng phương pháp này: Tại vì nó có nhiều ưu điểm, và những ưu điểm này lại là những hạn chế của phương pháp phân tích dựa vào gel: Cụ thể nó có thể phân tách được các protein kiềm (pI>11), các protein Acid (pI<3), các protein lớn (MW>100 kDa), các protein nhỏ (MW<20 kDa), các protein này rất khó hoặc không thể phân tách được trên 1D-gel hoặc 2D-gel. Nó đặc biệt đựơc ứng dụng trong phân tách protein màng.
- Phương pháp này cũng tương đối đơn giản, dịch protein thu được có thể được đưa vào phân tích khối phổ ngay.
- Cho đến hiện nay, người ta sử dụng 2 loại Kit để làm IP đó là Sepharose bead và Magnetic bead, hai loại hạt này đều được gắn cộng hóa trị với Protein G hoặc protein A. Loại magnetic bead chỉ mới được dùng cách đây khoảng 2-3 năm, còn loài Sepharose đã xuất hiện trên 10 năm rồi.
- Ngoài ra, theo tôi được biết nguyên lý của phương pháp này còn được ứng dụng trong nghiên cứu tế bào: cụ thể là dùng phương pháp này để tách các tế bào nuôi cấy quan tâm cũng dựa vào phản ứng KN-KT.

* Về WB.
- Mục đích là để Kiểm tra protein chúng ta quan tâm.
- Quy trình các bạn đều biết rồi nên tôi không trình bày nữa.
- Trong phương pháp IP, người ta sẽ dùng phương pháp WB để kiểm tra kết quả. Công việc kiểm tra này chỉ cần dùng trong giai đoạn tối ưu hóa phương pháp IP, còn khi phương pháp IP đã hoạt động tốt đối với mẫu của mình rồi thì các thí nghiệm về sau không cần dùng WB để kiểm tra nữa.
* Kết quả của phương pháp IP tôi đã từng post lên diễn đàn trong mục Dien di SDS-PAGE. Các bạn có thể quay lại đó xem và cùng trao đổi nhé.
Nếu bạn nào quan tâm sâu hơn về phương pháp này thì chúng ta co thể trao đổi nhiều hơn.
Hẹn gặp lại các bạn!

 

[Nguyễn Phương Thảo]

Immunoprecipitation mà Biochemistvn nói là co-IP, cần phân biệt với chromatin-IP.

-
Phương pháp này cũng tương đối đơn giản, dịch protein thu được có thể được đưa vào phân tích khối phổ ngay.

Bạn có làm MS/MS không?

-
- Cho đến hiện nay, người ta sử dụng 2 loại Kit để làm IP đó là Sepharose bead và Magnetic bead, hai loại hạt này đều được gắn cộng hóa trị với Protein G hoặc protein A. Loại magnetic bead chỉ mới được dùng cách đây khoảng 2-3 năm, còn loài Sepharose đã xuất hiện trên 10 năm rồi.

]
Vậy protein agarose beads thuộc loại nào? Ở bước này bạn cũng có thể lựa chọn giữa việc sử dụng beads và antibody đặc hiệu riêng biệt và loại đã gắn sẵn.

-
- Trong phương pháp IP, người ta sẽ dùng phương pháp WB để kiểm tra kết quả. Công việc kiểm tra này chỉ cần dùng trong giai đoạn tối ưu hóa phương pháp IP, còn khi phương pháp IP đã hoạt động tốt đối với mẫu của mình rồi thì các thí nghiệm về sau không cần dùng WB để kiểm tra nữa.

co-IP thực chất tách protein complexs chứ không phải 1 protein duy nhất khỏi total protein (mặc dù chỉ sử dụng 1 antibody đặc hiệu). Vậy nên tùy vào mục đích thí nghiệm mà nói WB có cho biết IP thành công hay không. Trong trường hợp dùng IP để phân tích các protein trong complex thì WB không nói lên điều gì cả.

 

[Trương Quốc Phong]

Immunoprecipitation mà Biochemistvn nói là co-IP, cần phân biệt với chromatin-IP.

Tất nhiên rồi

Bạn có làm MS/MS không?

Ngày nào cũng chạy MS nên bạn hiểu ý tôi viết trước đây chứ.

Vậy protein agarose beads thuộc loại nào? Ở bước này bạn cũng có thể lựa chọn giữa việc sử dụng beads và antibody đặc hiệu riêng biệt và loại đã gắn sẵn.

Đây là tôi đang nói về Kit còn cái mà bạn đề cập ở đây thì chúng ta có thể tự làm được trong phòng TN - tôi cũng đang gắn kháng thể của tôi lên Sepharose đó.

co-IP thực chất tách protein complexs chứ không phải 1 protein duy nhất khỏi total protein (mặc dù chỉ sử dụng 1 antibody đặc hiệu). Vậy nên tùy vào mục đích thí nghiệm mà nói WB có cho biết IP thành công hay không. Trong trường hợp dùng IP để phân tích các protein trong complex thì WB không nói lên điều gì cả.

Tách được 1 loại hay nhiều loại protein còn tùy thuộc vào Kháng thể mà bạn dùng. Nếu nó chỉ đặc hiệu cho duy nhất 1 loại protein mà bạn quan tâm (chỉ có "Duy nhât" một epitope) thì bạn cũng chỉ thu được 1 loại protein mà thôi. Còn đối với epitope mà nhiều loại protein cũng có thì tất nhiên là bạn sẽ tách được 1 hỗn hợp protein chứ không phải là một ví dụ như các protein được phosphoryl hóa, acetyl hóa, methyl hóa,...

Trong trường hợp dùng IP để phân tích các protein trong complex thì WB không nói lên điều gì cả.

Trong ý này bạn chỉ nên nói là "Chưa thể đưa ra kết luận cuối cùng" chứ không nên nói là "Không nói nên điều gì cả" vì nó đã cho phép ta đi đựơc khoảng 70% quãng đường rồi.
Cám ơn rất nhiều!

 

[Nguyễn Phương Thảo]

Bạn có làm MS/MS không?

Ngày nào cũng chạy MS nên bạn hiểu ý tôi viết trước đây chứ.....
Tách được 1 loại hay nhiều loại protein còn tùy thuộc vào Kháng thể mà bạn dùng. Nếu nó chỉ đặc hiệu cho duy nhất 1 loại protein mà bạn quan tâm (chỉ có "Duy nhât" một epitope) thì bạn cũng chỉ thu được 1 loại protein mà thôi. Còn đối với epitope mà nhiều loại protein cũng có thì tất nhiên là bạn sẽ tách được 1 hỗn hợp protein chứ không phải là một ví dụ như các protein được phosphoryl hóa, acetyl hóa, methyl hóa,...

Trong trường hợp dùng IP để phân tích các protein trong complex thì WB không nói lên điều gì cả.

Trong ý này bạn chỉ nên nói là "Chưa thể đưa ra kết luận cuối cùng" chứ không nên nói là "Không nói nên điều gì cả" vì nó đã cho phép ta đi đựơc khoảng 70% quãng đường rồi.

Đọc bài của bạn, tôi đoán cũng là người làm về protein nên hỏi vậy để có thời gian sẽ trao đổi thêm về MS, không có ý nói bạn sai. Tôi ít thời gian nên hay viết ngắn, xin lỗi nếu gây hiểu lầm.

Đoạn sau (về chuyện thu được 1 protein) thì tôi hơi ngạc nhiên. Tất nhiên tôi cũng nói kháng thể đặc hiệu theo nghĩa chỉ nhận dạng duy nhất 1 epitope. Vấn đề là sản phẩm IP của bạn (bạn dùng biện pháp nào để precipitate?) thực sự chỉ chứa 1 protein hay protein này nằm trong complexes với các interacting protein khác. WB có giúp bạn xác định được bạn không phá vỡ complex, không loại bỏ mất 1 số protein tương tác đặc hiệu hay còn để sót chưa loại bỏ hết nhiều protein không đặc hiệu?

 

[Trương Quốc Phong]

Về MS, cũng xin lỗi các bạn vì tôi cũng viết ngắn gọn nên không tránh được sự hiểu nhầm, thực tế trước khi viết tôi cũng đã nghĩ đến điều này nhưng nếu các bạn đã ít nhiều đọc về MS thì cũng sẽ hiểu ngay ý tôi thôi là vấn đề của chúng ta con trải qua một số khâu nữa.

Đoạn sau (về chuyện thu được 1 protein) thì tôi hơi ngạc nhiên. Tất nhiên tôi cũng nói kháng thể đặc hiệu theo nghĩa chỉ nhận dạng duy nhất 1 epitope. Vấn đề là sản phẩm IP của bạn (bạn dùng biện pháp nào để precipitate?) thực sự chỉ chứa 1 protein hay protein này nằm trong complexes với các interacting protein khác. WB có giúp bạn xác định được bạn không phá vỡ complex, không loại bỏ mất 1 số protein tương tác đặc hiệu hay còn để sót chưa loại bỏ hết nhiều protein không đặc hiệu?

Tôi không biết bạn ngạc nhiên ở điểm nào ? bạn giúp tôi nhé vì có thể tôi hiểu nhầm chăng.
Vấn đề dùng phương pháp nào để precipitate không liên quan đến việc thu được nhiều hơn 1 loại hay không mà lài hiệu xuất thu hồi protein quan tâm như thế nào. Nhưng trong bước này cũng rất quan trọng và đặc biệt lưu ý về sự bám không đặc hiệu của hỗn hợp protein vào bead hoặc protein G or A đã được gắn với bead, hoặc một vài sự bắt giữ khác. Chúng ta có thể loại bỏ được sự bám không đặc hiệu này bằng việc thực hiện bước preclearing, và một số thủ thuật khác.
Đối với các interacting protein, đúng cũng là 1 vấn đề. Nhưng chúng ta hoàn toàn có thể kiểm soát được điều này, kiểm soát nó ở bứơc nào? chúng ta có thể kiểm soát trong việc điều chỉnh thành phần đệm chiết, ngoài ra có thể can thiệp vào bước rửa. Nhưng thú thật với bạn, đối với các protein mà có khả năng bám rất chặt với các interacting protein thì quả thật cũng có vấn đề. Nhưng không sao, vì IP chưa phải là bước cuối cùng trong con đường của chúng ta nên việc loại đi những thằng protein khó chịu đó cũng sẽ thực hiện được ở các bước tiếp theo.

Ở đây tôi muốn nhấn mạnh là sự khác nhau giữa IP và WB là ở mục đích của phương pháp tức là dùng các phương pháp đó vào việc gì.
Xin cảm ơn!