Phương pháp PCR và enzyme nào có thể khuếch đại 17 TA repeat region?

[Nchicken]

Chào cả nhà,
Mọi người giải quyết giúp mình vấn đề này với. Mình đang cần cloning promoter có kích thước 2kb. Mình sử dụng phusion enzyme (HF buffer) để khuếch đại promoter. Nhưng đen đủi thay khi giải trình tự thì đoạn giữa promoter của mình đã bị thiếu mất 7 TA repeat (kết quả chỉ có 10 TA thay vì 17 TA).
Mình đã làm 3 phản ứng PCR độc lập và cloning, giải trình tự ít nhất 3 clonies từ mỗi phản ứng PCR. Và đều nhận kết quả như vậy.
Bạn nào có kinh nghiệm trong vấn đề này giúp mình được không?
Mình có thể chuyển sang dùng loại enzyme nào khác?
Cảm ơn mọi người giúp đỡ

 

[Ho Huu Tho]

@Nchicken:
- Bạn thử search theo keyword "slippage" và "DNA replication" để tìm hiểu xem.
- Bạn thử với enzyme Kapa HiFi DNA polymerase xem có cải thiện được tình hình không. Bạn cũng có thể xem xét khả năng tiến hành PCR với nhiệt độ kéo dài chuỗi thấp hơn bình thường.

 

[Nchicken]

Em cũng đã đọc về DNA replication và em đoán là PCR của em bị đúng như thế Nhưng vấn đề của em cần có đúng 17 repeat TA vì em đang làm về cis regulatory element.
Em đang thử đổi HF buffer sang GC buffer (mặc dù GC buffer là sử dụng cho gene rich GC) và thử cho thêm DMSO (cái này em tra trên internet và có 1 số bạn gặp cùng vấn đề, họ thử làm và trời đẹp thì ra sản phẩm)
Em cảm ơn ý kiến của anh Thọ, sau khi đổi buffer nếu không thành công thì em sẽ thử hạ thấp extension temperature. Anh có kinh nghiệm nên để extension ở nhiệt độ nào không ạ?

 

[Ho Huu Tho]

Nckicken có thể xem xét khả năng chạy PCR với gradient nhiệt độ kéo dài chuỗi từ 45-68°C. Hoạt tính của enzyme sẽ thấp hơn ở 72°C nên có thể phải điều chỉnh thời gian kéo dài chuỗi.

 

[Nchicken]

Em cảm ơn anh Thọ.
Em đã giảm elongation temperature và em đã có được sản phẩm PCR mong muốn ạ.