bạn nào dịch dùm mình bài này với

hanh_bio

Junior Member
Rapid and Specific Genotyping System for Hepatitis B Virus
Corresponding to Six Major Genotypes by PCR
Using Type-Specific Primers​
HIDEO NAITO,1,2 SHIGEKI HAYASHI,2 AND KENJI ABE1*
Department of Pathology, National Institute of Infectious Diseases,1 and Division of
Gastroenterology, International Medical Center of Japan,2 Tokyo, Japan
Received 5 June 2000/Returned for modification 17 August 2000/Accepted 16 October 2000


--------------------------------
A simple and precise genotyping system based on PCR using type-specific primers was developed for thedetermination of genotypes A through F of hepatitis B virus (HBV). This assay system is considered to be auseful tool for the molecular diagnosis of HBV infection and for large-scale surveys.

Hepatitis B virus (HBV) is a well-known agent of acute and chronic hepatitis, with an estimated 350 million chronic carriersaround the world. HBV has a circular and partially doublestranded
DNA genome of 3.2 kb containing four overlapping open reading frames. HBV strains isolated worldwide have been classified into six genomic groups deduced from genome comparisons and designated genotypes A to F (3, 6, 7). The HBV genotypes have a characteristic geographic distribution.
HBV genotyping by phylogenetic analysis based on nucleotide sequences produces the most reliable and certain genotyping results. However, this is not an appropriate method for largescale genotyping. On the other hand, several groups have reported the genotyping of HBV by the restriction fragment length polymorphism method (1, 2, 4, 8). However, their methods were not so sensitive and specific compared with our PCR genotyping method. In this paper, we report a simpler, more rapid, and more specific genotyping system for HBV involving PCR using type-specific primers.
A total of 55 HBV DNA-positive serum samples obtained from individuals in six different countries,including Japan, Vietnam, the United States, Egypt, Ghana, and Bolivia, were used for the evaluation of our genotyping system. We selected the HBV DNA-positive samples by nested PCR. The sequences of PCR primers used in this study are shown in Table
1. The first-round PCR primers (outer primer pairs) and second- round PCR primers (inner primer pairs) were designed on the basis of the conserved nature of nucleotide sequences in regions of the pre-S1 through S genes, irrespective of the six HBV genotypes. P1 (sense) and S1-2 (antisense) were universal outer primers (1,063 bases). B2 was used as the inner primer (sense) with a combination called mix A for genotypes A, B, and C. Mix A consisted of antisense primers BA1R (type A specific), BB1R (type B specific), and BC1R (type C specific). B2R was used as the inner primer (antisense) with a combination called mix B for genotypes D, E, and F. Mix B consisted of sense primers BD1 (type D specific), BE1 (type Especific), and BF1 (type F specific). These primer combinations for second-round PCR were designed on the basis of the differences in the sizes of the genotype-specific bands. The type-specific primers were designed on the basis of the conserved nature of those sequences within a genotype and on the basis of their poor homology with the sequences derived from other HBV genotypes. The strategy for HBV genotyping isillustrated in Fig.

The nucleic acid was extracted from 100-ml serum samples using a nucleic acid extraction kit (SepaGene RV-R; Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokyo, Japan). The resulting pellet was resuspended in RNase-free water and then subjected to nested PCR. We amplified the HBV genome by nested PCR using the universal primers (P1 and S1-2) for the outer primers, followed by two different mixtures containing type-specific inner primers as described above. The first PCR was carried out in a tube containing 40 ml of a reaction buffer made up of the following components: 50 ng of each outer primer, a 200 mM concentration of each of the four deoxynucleotides, 1 U of AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.), and 13 PCR buffer containing 1.5 mM MgCl2. We used AmpliTaq Gold DNA polymerase to obtain an automatic hot-start reaction.The thermocycler (GeneAmp PCR system 2400, 9600,
and 9700; Perkin-Elmer) was programmed to first incubate the samples for 10 min at 95°C, followed by 40 cycles consisting of 94°C for 20 s, 55°C for 20 s, and 72°C for 1 min. As illustrated in Fig. 1, two second-round PCRs were performed for each sample, with the common universal sense primer (B2) and mix A for types A through C and the common universal antisense primer (B2R) and mix B for types D through F. A 1-ml aliquot of the first PCR product was added to two tubes containing the second sets of each of the inner primer pairs, each of the deoxynucleotides, AmpliTaq Gold DNA polymerase, and PCR buffer, as in the first reaction. These were amplified for 40 cycles with the following parameters: preheating at 95°C for 10 min, 20 cycles of amplification at 94°C for 20 s, 58°C for 20 s, and 72°C for 30 s, and an additional 20 cycles of 94°C for 20 s, 60°C for 20 s, and 72°C for 30 s. Genotypes of HBV for each sample were determined by identifying the genotype-specific DNA bands. The two different second-round PCR products from one sample were separately electrophoresed on a 3% agarose gel, stained with ethidium bromide, and evaluated under UV light. The sizes of PCR products were estimated
according to the migration pattern of a 50-bp DNA ladder (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). To test the validity of our PCR genotyping system, genotypes of HBV were also determined by phylogenetic analysis of pre-S1 through S genes in 40 samples. Amplified PCR products were subjected to direct sequencing, and then phylogenetic analysis was performed as reported previously (5).Mix A allows for the specific detection of PCR products for types A, B, and C, and mix B allows for detection of types D,
E, and F. As shown in Fig. 2, type-specific PCR products were recognized clearly by their distinct sizes in gel electrophoresis.
When 28 isolates in the panel (5 samples from each genotypeexcept for type E), for which serum samples were available,were typed by PCR, the results were in complete accord with the sequences corresponding to their type-specific primers. In the second stage of PCR, type A HBV DNA was amplified with the type A-specific primer, but not with other type-specific primers. Furthermore, to confirm the specificity of our PCR assay, we compared the genotyping results between typing by PCR and by phylogenetic analysis for the 40 samples examined.
The results showed 100% concordance between the two assays. In addition, the alignment of the representative pre-S1 through S genes of HBV isolates in the present study revealed that there was a consensus sequence at the same nucleotide positions among different isolates from each genotype. Using this new assay system, we investigated the geographic distribution of HBV genotypes in various countries. The data showed that the distribution of the HBV genotypes in this study population was in accord with the known geographic distribution of HBV genotypes (Table 2).
The genotyping of HBV is important to clarify the route and pathogenesis of the virus. In particular, the examination of sequence diversity among different isolates of the virus is important, because variants may differ in their patterns of serologic reactivity, pathogenicity, virulence, and response to therapy.
On the other hand, HBV has genetic variations which correspond to the geographic distribution, and it has been proposed that HBV can be classified into six major genotypes (3, 6, 7). In designing the genotype-specific PCR primers, it is well established that not only higher matching in the entire sequences but also the matching of the two to three nucleotides at the 39 ends is one of the important parameters for specific priming. Based on this fact, we designed type-specific PCR primers. Sequences within the same genotype were different by >=2 nucleotides among the entire sequences of the genotype-specific primer, while the sequence within the different genotypes had a difference of =<3 nucleotides. In the present study, a new genotyping method, based on type-specific primers for PCR, by which HBV isolates can be classified into genotypes A through F is described. To confirm the specificity
of the results of PCR typing, phylogenetic analysis in the pre-S1 through S genes of HBV was also performed, and we confirmed the specificity of the results obtained with our PCR genotyping system. This method is very convenient and will assist research workers in conducting large-scale epidemiological studies. Additional investigations, using the serum samples from other geographic regions, are required for the further classification and characterization of HBV. In fact, Stuyver et al. (9) reported recently the identification of a novel genotype of HBV (designated genotype G). For this purpose, our genotyping
system using the PCR method introduced here will be useful.
In conclusion, we reported on a newly developed precise PCR genotyping system using type-specific primers, allowing the identification of types A through F. This assay system may be useful for rapid and sensitive genotyping of the HBV genome when either epidemiological, pathological, or transmission studies of this agent are carried out in large scale.
We thank Tetsutaro Sata (National Institute of Infectious Diseases) for his continuous encouragement during this study. We also thank Chiaki Miyoshi (International Medical Center of Japan), Ko-ichi Ishikawa
and Yutaka Takebe (National Institute of Infectious Diseases),Vo Xuan Ouang and Banh Vu Dien (Cho Ray Hospital, Ho Chi Minh City, Vietnam), Abdel Rahman El-Zayadi (Cairo Liver Center, Cairo,
Egypt), and Alfred M. Prince (New York Blood Center, New York,N.Y.) for providing valuable serum samples.This study was supported in part by a Grant-in-Aid for Science Research of the Ministry of Education, Science and Culture of Japan, by the Ministry of Health and Welfare of Japan, and by an International Medical Cooperation Research Grant of Japan.



mình có dịch sơ qua thử nhưng mà tiếng anh ngu quá nên thấy sai be bét ah bạn nào giúp mình với:please:
:cry:
 
Virus viêm gan B được biết là nguyên nhân gây ra bệnh viêm gan cấp và mãn tính với ước lượng 350 triệu người mắc bệnh trên toàn thế giới. Virus viêm gan B có hình tròn, cùng với bộ gen DNA sợi kép, kích thước 3.2kb với 4 khung đọc chồng chéo nhau. Chủng phân lập của HBV trên toàn thế giới được phân thành 6 nhóm từ sự so sánh hệ gen và các kiểu gen di truyền từ A đến F ( 3,6,7). Mỗi kiểu gen của HBV lại phân bố rải rác đặc trưng theo địa lý.
Kiểu gen của HBV được phân tích phát sinh loại dựa trên nền tảng chuỗi nucleotide cho ra kết quả chắc chắn và đáng tin cậy nhất. Tuy nhiên, đây không phải là phương pháp thích hợp cho những kiểu gen có phạm vi rộng lớn. Mặt khác, một số nhóm riêng đã báo cáo về kiểu gen của HBV bằng phương pháp đa hình hạn chế chiều dài ( 1,2,4,8). Tuy vậy, những phương pháp của họ không nhạy và đặc hiệu bằng phương pháp kiểu gen PCR của chúng tôi. Trong tài liệu này, chúng tôi báo cáo hệ thống đơn giản hơn, nhanh hơn và đặc hiệu hơn đối với HBV, sử dụng mồi đặc PCR.
 
Có tổng cộng 55 mẫu huyết thanh (+) thu thập được từ những cá nhân trên 6 quốc gia khác nhau, bao gồm Nhật Bản, Việt Nam, Hoa Kỳ, Ai Cập, Ghana và Bolivia, đã được sử dụng cho việc định giá của hệ thống kiểu gen của chúng tôi. Chúng tôi đã chọn những mẫu virus viêm gan B tích cực bằng cách xếp lồng PCR. Các trình tự mồi PCR được dùng trong thí nghiệm này được trình bày trong bảng (1). Vòng đầu tiên của mồi PCR ( cặp mồi bên ngoài) và vòng thứ 2 của mồi PCR ( cặp mồi bên trong) được thiết kế trên nền tảng tính chất bảo tồn tự nhiên của chuỗi Nucleotide trong khu vực trước S1 xuyên qua gen S, không kể 6 kiểu gen của HBV.
P1 ( cảm quan) và S1,2 ( không cảm quan) mồi phổ bên ngoài ( 1.063 nền tảng). B2 được sử dụng giống như mồi phổ bên trong ( cảm quan) với sự phối hợp được gọi là hỗn hợp A cho các kiểu gen A, B và C. Hỗn hợp A gồm có những mồi không cảm quan BA1R ( type A đặc hiệu), BB1R ( type B đặc hiệu) và BC1R ( type C đặc hiệu). B2R được sử dụng như mồi phổ bên trong ( không cảm quan) với sự phối hợp được gọi là hỗn hợp B cho các kiểu gen D, E, F. Hỗn hợp B bao gồm những mồi cảm quan BD1 ( type D đặc hiệu), BE1 ( type E đặc hiệu) và BF1 ( type F đặc hiệu).
Những sự kết hợp mồi cho vòng PCR thứ 2 được thiết kế trên cơ sở những sự khác biệt trong kích thước của những dải gen đặc hiệu. Các loại mồi cụ thể được phác thảo trên cơ sở của sự bảo tồn tự nhiên của những trình tự trong 1 kiểu gen và cơ sở của tính tương đồng hiếm hoi của chúng với các dãy lấy được từ các kiểu gen khác của HBV. Chiến lược cho kiểu gen virus HBV được mô tả dưới bảng 1, hình 1.
Các axit nucleic được chiết ra từ 100ml trong mẫu huyết thanh bằng cách sử dụng 1 loại dụng cụ chiết xuất (SepaGene RV-R; Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokyo, Japan). Kết quả được đưa vào trong nước Rnase tự do rồi sau đó lồng vào PCR. Chúng tôi khếch đại kiểu gen HBV bằng lồng ghép PCR, sử dụng mồi phổ phổ thông ( P1 – S1,2) cho những mồi phổ bên ngoài. Theo đó là 2 hỗn hợp khác nhau có chứa loại mồi đặc bên trong như đã mô tả phía trên.
 
PCR đầu tiên được thực hiện trong 1 ống chứa 40ml vật đệm phản ứng của những thành phần sau: 50ng của mỗi lớp sơn lót bên ngoài, bốn deoxynuclotides, mỗi cái 200mM, 1 U of AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn) và PCR đệm có chứa 1.5 mM MgCl2. Chúng tôi sử dụng AmpliTaq Gold DNA polymerase để thu được 1 phản ứng nóng tự động. Chu trình nhiệt ( còn gọi là máy Thermocycler PCR hoặc máy khếch đại DNA) được cài đặt, lập trình để nung ấp mẫu trong 10’ với 95oC. Chu trình tiếp sau đó là 40 chu kỳ gồm 90oC trong 20s, 55oC trong 20s và 72oC trong 1 phút. Giống như được trình bày ở bảng 1, 2 vòng PCR thứ 2 được thực hiện cho mỗi mẫu với mồi có ý nghĩa tổng quát chung (B2) và hỗn hợp A theo thứ tự từ A đến C cùng mồi vô nghĩa (B2R) cùng hỗn hợp B theo thứ tự từ D qua tới F.
 
Em muốn tham khảo cái gì trong này!? Protocol hay là phương pháp PRC!?

P/s: Dịch nhìu chỗ bị sai kìa RNAse-free water là nước kg có RNAse...
 
Bó tay, cứ đọc-dịch thế này thì ....
________
Bài trên chỉ có 2 ý chính: 1 Giới thiệu 1 Phương pháp PCR để xét nghiệm/xác định chủng virus và... quảng cáo phương pháp đó là chính xác (>.<)
Phương pháp này đc dựa trên PCR 2 lần. Lần đâu là nhân 1 đoạn DNA "phổ thông" dùng outer primer. Outer primers là cặp primer để nhân 1 đoạn DNA lớn, từ đoạn DNA này sẽ dùng những đoạn primer đặc hiệu (inner primer) để PCR lần 2 nhằm tìm xác định chủng virus. Đoạn DNA "phổ thông" (nested) là đoạn trước gene S1 cho tới gene S, tất cả các chủgn đều có đoạn này, tuy nhiên, mỗi chủng có những đoạn đặc trưng nhỏ nằm trong đoạn này.

Outer primers là P1 (forward) và S1-2 (backward).
Inner primer đc thiết kế thành 2 loại:
- Mix A là hỗn hợp primer đặc hiệu cho type A-B-C HBV
- Mix B là hợp hợp Primer đặc hiệu cho type D-E-F HBV.
cả 2 Mix A và mix B đều là antisense primers (backward). Dùng chung với B2 là sense (forward) primer.

Protocol:
1. Đầu tiên, các mẫu thử (100ml) sẽ đc tách DNA, DNA sau đó đc chuyển sang pellet chứa nước cất kg có RNAse để chạy PCR lần 1 (dùng outer primer). Lần PCR đầu tiên có:
- 50ng mỗi primer (P1 & S1-2)
- 200mM mỗi Deoxynucleotides
- 1 U AmpliTad Gold DNA polymerase.
- 13 dung dịch đệm PCR chứa 1.5mM MgCl2
Dung dịch này sẽ đc cho chạy PCR 10 phút ở 95*C, sau đó là 40 vòng PCR (chi tiết coi bản gốc).

2. Lần PCR thứ 2 (với inner primers) đc thực hiện 2 lần cho mỗi mẫu. B2 dùng làm sense primer chung cho mix A và Mix B. 1ml của mẫu DNA "phổ thông" (dung dịch sau khi chạy PCR lần 1) đc cho vào 2 ống thử, mỗi ống là 1 set chạy PCR (chạy 2 lần mà). Thành phân như trên (giống lần 1), chạy PCR 40 vòng (chi tiết xem lại bản gốc) sau đó thêm tiếp 20 vòng nữa (chi tiết... ).

3. 2 sản phẩm của PCR lần 2 sẽ đc chạy gel 3% agarose để tìm đoạn gene đặc trưng cho từng chủng. Đặc trưng của từng gene đc tìm dựa theo khối lượng đoạn DNA (dựa vào kết quả điện di). Kiểu gene của các mẫu cũng sẽ đc phân tích phylogenetic (chả biết là cái gì) để xác nhận kết quả điện di. Phân tích phylogenetic dựa trên mẫu DNA "phổ thông" (sản phẩm PCR lần 1 - đoạn từ S1 cho tới S), sản phẩm sẽ đc giải trình tự gene trực tiếp, sau đó chuyển sang phân tích phylogenetic.

4. Kết quả: Mix A phát hiện ra chùng virus type A-B-C, và mix B phát hiện ra đc type D-E-F, cho kết quả rõ ràng và chính xác. Các mẫu thử phát hiện rất chính xác và đặc hiệu, type A đc phát hiện bới primer đặc hiệu trong Mix A và kg có false positive, kết quả đc xác nhận bằng phân tích phylogenetic. Kết quả giữa 2 set (2 lần PCR) 100% tương đồng với nhau.

Phần sau cuối chỉ là quảng cáo :hihi:. Phương pháp PCR này cho phép phát hiện HBV trên các mẫu ở các khu vực địa lý khác nhau (từ US cho tới VN :dance:), độ chính xác cao, nhạy, và nhanh (!?).
Sequences within the same genotype were different by >=2 nucleotides among the entire sequences of the genotype-specific primer, while the sequence within the different genotypes had a difference of =<3 nucleotides.

Chả biết dịch thế nào đoạn này, nhưng nói chung là đoạn primer đc thiết kế rất đặc hiệu cho từng type.
 
Một hệ thống xác định kiểu gen đơn giản và chính xác dựa trên PCR sử dụng các đoạn mồi Type-specific đã được phát triển để xác định các kiểu gen từ A đến F của virus viêm gan B (HBV). Hệ thống xét nghiệm này được xem như một công cụ hữu ích cho việc chẩn đoán phân tử của việc lây nhiễm HBV và cho các cuộc khảo sát phạm vi lớn.
Virus viêm gan B được biết đến như là tác nhân phổ biến gây viêm gan mãn tính và cấp tính, với ước tính 350 triệu người bệnh mãn tính trên khắp thế giới. HBV là phân tử DNA có kích thước 3.2kb dạng vòng và có cấu trúc mạch kép không hoàng toàn chứa 4 khung đọc mở chồng lên nhau. Các chủng HBV trên toàn thế giới được chia thành 6 nhóm gen được suy ra từ việc so sánh bộ gen và các kiểu gen được chỉ định A đến F(3,6,7). Các kiểu gen HBV có sự phân bố địa lý đặc trưng. Việc xác định kiểu gen HBV bằng việc phân tích phát sinh loài(phylogenetic) dựa trên các chuỗi nuleotide cho ra những kết quả kiểu gen chắc chắn và đáng tin cậy nhất. Tuy vậy, đây không phải là phương pháp thích hợp đối với các kiểu gen quy mô lớn. Mặt khác, một vài nhóm lại báo cáo kiểu gen HBV bằng phương pháp “the restriction fragment length polymorphism method(1,2,4,8)”. Tuy nhiên khi so sánh với phương pháp PCR của chúng tôi thì những phương pháp của họ không nhạy và rõ ràng. Trong bài báo này, chúng tôi báo cáo một hệ thống xác định kiểu gen (genotyping) đơn giản hơn, nhanh hơn và rõ ràng hơn cho HBV liên quan đến PCR sử dụng các đoạn mồi type-specific.
Tổng cộng 55 mẫu huyết thanh dương tính-DNA được lấy từ những cá thể của 6 nước khác nhau, bao gồm Nhật, VN, Mỹ, Ai Cập, Ghana, và Bolivia, được sử dụng để đánh giá hệ thống xác định kiểu gen của chúng tôi. Chúng tôi chọn các mẫu dương tính -DNA HBV bằng phương pháp PCR lồng. Các chuỗi của các đoạn mồi PCR sử dụng trong nghiên cứu này được thể hiện ở bảng 1.
Các đoạn mồi PCR vòng đầu tiên(các cặp mồi bên ngoài) và vòng thứ hai (các cặp mồi bên trong) được thiết kế trên cơ sở tính chất bảo tồn của các chuỗi nucleotide trong vùng các gen pre-S1 đến S, không kể 6 kiểu gen HBV. P1(sense) và S1-2(antisense) là các đoạn mồi nằm bên ngoài(1063 bases). B2 được sử dụng như đoạn mồi bên trong (senses) với một hợp chất được gọi là hỗn hợp A cho các kiểu gen A, B, C. Hỗn hợp A bao gồm các đoạn mồi antisense BAR1(type A specific), BB1R(type B specific), and BC1R(type B specific). B2R được sử dụng như đoạn mồi bên trong (antisense) với một hợp chất được gọi là hỗn hợp B cho các kiểu gen D,E, F. Hỗn hợp bao gồm các đoạn mồi sense BD1( type D specific), BE1(type E specific) và BF1(type F specific). Các hợp chất mồi này cho PCR vòng 2 được thiết kế trên cơ sở những sự khác nhau trong kích thước của các dải kiểu gen cụ thể. Các loại mồi cụ thể được thiết kế dựa trên cơ sở các tính chất bảo tồn của các chuỗi đó trong một kiểu gen và trên cơ sở tính tương đồng (homology) kém bắt nguồn từ các kiểu gen HBV khác. Chiến lược cho việc xác định kiểu định HBV được trình bày ở Hình 1.
Axit nucleit được chiết xuất từ 100ml các mẫu huyết thanh bằng cách sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất axit nucleit (SepaGene RV-R; Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokyo, Nhật Bản). Viên (pellet) kết quả được treo lơ lửng lại trong nước không có R-Nase và sau đó được đưa đến PCR lồng nhau. Chúng tôi khuếch đại bộ gen HBV bằng PCR lồng nhau sử dụng các đoạn mồi phổ biến (P1, S1-2) đối với các đoạn mồi bên ngoài, được theo sau bởi các đoạn mồi bên trong chứa 2 hỗn hợp khác nhau như mô tả ở trên. PCR đầu tiên được thực hiện trong một cái ống chứa một đệm phản ứng 40 ul được cấu tạo từ các thành phần sau: mỗi đoạn mồi bên ngoài 50 ng, 4 deoxynucleotic nồng độ 200 micro M, 1U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.), và 1 đệm PCR chứa 1.5mM MgCl2. Chúng tôi sử dụng AmpliTaq Gold DNA polymerase để chứa phản ứng bắt đầu-nóng( hot-start) tự động. Đầu tiên bộ chu trình nhiệt (hệ thống PCR GenaAmp 2400, 9600, và 9700; Perkin-Elmer) được lập trình để ủ các mẫu trong 10 phút ở nhiệt độ 95 độ C, được theo sau bởi 40 chu trình bao gồm 94°C trong 20 giây, 55°C trong 20 giây, và 72°C trong 1 phút. Như đã trình bày ở Hình 1, hai PCR vòng hai được thực hiện cho mỗi mẫu, với đoạn mồi sense phổ biến chung(B2) và hỗn hợp A cho các loại A đến C và đoạn mồi antisense phổ biến chung (B2R) và hỗn hợp B cho các loại D đến F. Một ước số 1 micro lít của sản phẩm PCR đầu tiên được thêm vào 2 ống chứa bộ thứ 2 của mỗi cặp mồi bên trong, mỗi deoxynucleotic, AmpliTaq Gold DNA polymerase, và đệm PCR, như trong phản ứng đầu tiên. Những thứ này sẽ được khuếch đại trong 40 chu trình với các thông số sau: làm nóng trước ở 95°C trong 10 phút, 20 chu trình khuếch đại ở 94°C trong 20 giây, 58°C trong 20 giây, và 72°C trong 30 giây, và thêm 20 chu trình ở 94°C trong 20 giây,
60°C trong 20 giây, và 72°C trong 30 giây. Các kiểu gen của HBV đối với mỗi mẫu được xác định bằng việc nhận diện các dải kiểu gen cụ thể DNA. Hai sản phẩm PCR vòng 2 khác nhau từ 1 mẫu được điện di riêng biệt trong chất keo agarose 3%, được nhuộm màu với ethidium bromide và được đánh giá
dưới ánh sáng tia cực tím. Các kích thước của các sản phẩm PCR được ước tính theo mô hình di trú của thang DNA 50-bp (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
Để kiểm tra hiệu lực của hệ thống xác định kiểu gen PCR, các kiểu gen HBV cũng được xác định bằng phân tích phát sinh loài(phylogenetic) của pre-S1 đến S trong 40 mẫu. Các mẫu PCR đã khuếch đại được đưa đến sắp dãy trực tiếp, sau đó việc phân tích phát sinh loài (phylogenetic) được thực hiện như đã thông báo trước (5)
Trộn A cho phép phát hiện cụ thể các sản phẩm PCR loại A, B, C, và kết hợp B cho phép phát hiện các loại D, E, và F. Như trong hình. 2, loại sản phẩm PCR cụ thể đã được công nhận rõ ràng bởi kích thước khác biệt của nó trong điện di gel. Khi 28 chủng trong bảng điều khiển (5 mẫu từ mỗi kiểu gen
ngoại trừ loại E), mẫu huyết thanh đã có sẵn, đã được đánh máy bằng phương pháp PCR, kết quả hoàn toàn phù hợp với trình tự tương ứng với mẫu type-specific của nó. Trong giai đoạn thứ hai của PCR, type A của HBV, DNA được khuếch đại với loại type A-mồi đặc trưng nhưng không phải với tất cả các loại mồi đặc trưng. Hơn nữa, để xác nhận các đặc trưng của PCR trong khảo nghiệm , chúng tôi so sánh các kết quả kiểu gen giữa mẫu bằng PCR và phát sinh loài trong phân tích 40 mẫu kiểm tra. Các kết quả cho thấy 100% sự phù hợp giữa hai xét nghiệm. Ngoài ra, sự liên kết của các vùng gen pre-S1 tới gen S của HBV được phân lập trong nghiên cứu này cho thấy rằng có một chuỗi đồng nhất tại cùng một nucleotide vị trí giữa các phân lập khác nhau trên mỗi kiểu gen. Sử dụng hệ thống xét nghiệm mới này, chúng tôi điều tra sự phân bố của kiểu gen HBV ở các nước khác nhau. Các dữ liệu cho thấy rằng sự phân bố các kiểu gen HBV trong dân số nghiên cứu phù hợp với sự phân bố địa lý đã biết
của các kiểu gen HBV (Bảng 2).
Các kiểu gen của HBV quan trọng đối với việc làm rõ các tuyến đường và sinh bệnh học của virus. Đặc biệt, việc kiểm tra trình tự đa dạng giữa các phân lập khác nhau của virus là rất quan trọng, bởi vì các biến thể có thể khác nhau về mô hình của huyết thanh phản ứng, khả năng gây bệnh, độc lực, và phản ứng đối với điều trị. Mặt khác, HBV có biến thể di truyền tương ứng với sự phân bố địa lý, và nó đã được đề nghị phân loại HBV thành sáu kiểu gen chính (3, 6, 7). Trong thiết kế PCR mồi đặc trưng, được thành lập không chỉ phù hợp trong toàn bộ trình tự, mà còn kết hợp của hai đến ba nucleotide trong đầu 3’ đó là một trong các thông số quan trọng cho đoạn mồi đặc trưng. Căn cứ vào thực tế này, chúng tôi thiết kế lọai mồi đặc trưng cho PCR. Trình tự trong cùng một kiểu gen khác nhau ≤ 2 nucleotide trong trình tự toàn bộ kiểu gen có mồi đặc trưng, trong khi các trình tự khác nhau trong kiểu gen đã có một sự khác biệt của ≥3 nucleotide . Trong nghiên cứu, một phương pháp kiểu gen mới, dựa trên loại mồi đặc trưng cho PCR, phân lập HBV có thể được phân loại vào kiểu di truyền từ A đến F a được mô tả. Để xác nhận kết quả PCR đánh máy, phân tích phát sinh loài trong gen pre-S1 đến S của HBV cũng được thực hiện, và chúng tôi xác nhận đặc trưng của các kết quả thu được đối với PCR trong hệ thống kiểu gen. Phương pháp này là rất thuận tiện và sẽ hỗ trợ nhân viên nghiên cứu tiến hành nghiên cứu dịch tễ học ở quy mô lớn. Các điều tra, bằng cách sử dụng các mẫu huyết thanh từ các vùng địa lý khác, được yêu cầu cho phân loại và đặc tính của HBV. Trong thực tế, gần đây Stuyveretal. (9) báo cáo việc xác định một kiểu di truyền HBV (được dùng với kiểu gen G). Đối với mục đích này, kiểu gen hệ thống bằng cách sử dụng phương pháp PCR giới thiệu ở đây sẽ được hữu ích.
Trong kết luận, chúng tôi báo cáo chính xác về một hướnng mới phát triển PCR của kiểu gen hệ thống sử dụng mồi đặc trưng, cho phép việc xác định các loại từ A đến F. hệ thống khảo nghiệm có thể hữu ích cho các kiểu gen nhanh chóng và nhạy cảm của bộ gen HBV khi dịch tễ học, bệnh lý, hoặc truyền nghiên cứu của đại lý này được thực hiện ở quy mô lớn.
Hum bữa ngồi dịch sơ sơ như rứa mà thèng bạn kêu sai nhìu quá >"< chẳng biết sai ở đâu :???:
 
Viên (pellet) kết quả được treo lơ lửng lại trong nước không có R-Nase và sau đó được đưa đến PCR lồng nhau
Pellet là cái cặn sau khi quay ly tâm.
Resuspended là pha cái cặn đó (đang mất nước) vào nước. Nôm na là tạo lại huyền phù!
Nestes Là dạng mẫu đầu tiên cho 1 chuỗi mẫu thử, có thể gọi là phổ thông. (vd khi nuôi cấy vi sinh có 1 dung dịch đầu tiên, sau đó từ dung dịch này pha loãng ra các dung dịch khác - ống 1-> ống 2, ống 1 -> ống 3,... ống 1 gọi là nestes!

Dịch cho hiểu thì đúng rồi, nhưng mà dịch cho ng khác đọc thì sai nhiều lắm =)). Đoán cái này từ google translate sau đó sửa lại đúng kg !? =))
Nếu muốn tiếng Anh chuyên nghành giỏi, mình thật lòng khuyên bạn đừng bao giờ dịch để hiểu. Học tiếng Anh bằng tiếng Anh!!!
 

Facebook

Thống kê diễn đàn

Threads
11,649
Messages
71,550
Members
56,918
Latest member
sv368net
Back
Top