Quy trình tách chiếc DNA từ tế bào E.coli?
- Thread starter 09cs.cc
- Start date
Phải hỏi lại cô giáo là cô muốn tách DNA chromosome hay DNA plasmid?
orion8x
Senior Member
Tách plasmid và tách chromosomal khác nhau nhiều lắm. Tách chromosomal dùng neutral lysis còn tách plasmid dùng alkaline lysis.
Nếu là vi khuẩn thì rất có khả năng yêu cầu tách plasmid
1. Nuôi cấy trong môi trường thích hợp qua đêm, sau đó thu hoạch. Quay li tâm để thu lấy tế bào.
2. Cho vào dung dịch 1 gồm có Tris buffer, EDTA, va RNase, glucose. EDTA ngăn chặn sự phân rã (degraded) của DNA, RNase phân rã RNA và glucose cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào.
3. Sau đó cho vào dung dịch 2 gồm có NaOH, SDS. SDS đông tụ các protêin, NaOH phá vớ màng tế bào và quan trọng hơn, kết tủa DNA (và cả protein).
4. Trong dung dịch lúc này có 2 phần phần lỏng gồm EDTA, RNase, Glucose... và phần kết tủa gồm có Protein và DNA (cả chromosomal DNA và plasmid). Tiếp theo cho vào dung dịch 3 có Kali acetate, mục đích là giảm pH của dung dịch làm cho plasmid DNA tan ra (renatured), tuy nhiên chromosomal DNA vẫn bị kết tủa.
5. Giờ chúng ta li tâm, bỏ phần cặn (protein và chromosomal DNA kết tủa), phần dung dịch tiếp tục dùng phenol/chloroform để tách DNA tinh khiết.
Nếu là vi khuẩn thì rất có khả năng yêu cầu tách plasmid
1. Nuôi cấy trong môi trường thích hợp qua đêm, sau đó thu hoạch. Quay li tâm để thu lấy tế bào.
2. Cho vào dung dịch 1 gồm có Tris buffer, EDTA, va RNase, glucose. EDTA ngăn chặn sự phân rã (degraded) của DNA, RNase phân rã RNA và glucose cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào.
3. Sau đó cho vào dung dịch 2 gồm có NaOH, SDS. SDS đông tụ các protêin, NaOH phá vớ màng tế bào và quan trọng hơn, kết tủa DNA (và cả protein).
4. Trong dung dịch lúc này có 2 phần phần lỏng gồm EDTA, RNase, Glucose... và phần kết tủa gồm có Protein và DNA (cả chromosomal DNA và plasmid). Tiếp theo cho vào dung dịch 3 có Kali acetate, mục đích là giảm pH của dung dịch làm cho plasmid DNA tan ra (renatured), tuy nhiên chromosomal DNA vẫn bị kết tủa.
5. Giờ chúng ta li tâm, bỏ phần cặn (protein và chromosomal DNA kết tủa), phần dung dịch tiếp tục dùng phenol/chloroform để tách DNA tinh khiết.
orion8x
Senior Member
Quên mất, nếu chỉ tách DNA kg thì đơn giản hơn (cái này tại đc học sơ sài vì kg có ứng dụng ).
1. Nuôi cấy, thu hoạch, li tâm, blah blah blah.
2. Phá vỡ màng tế bào = enzyme, tùy tế bào mà chọn. E.coli khá đơn giản nên chọn lysosome và serine protase.
3. Trong dung dịch giờ có protein và DNA. Cho phenol vào, phenol kg tan trong nước, nhưng hòa tan protein. Hút nước (có DNA) và đổ bỏ phenol => xong
P/s: Tách lý thuyết thì như thế, như khi tách để làm thí nghiệm sau (chay gel chẳng hạn) thì phải làm khác một chút để thu DNA tinh khiết hơn.
). 1. Nuôi cấy, thu hoạch, li tâm, blah blah blah.
2. Phá vỡ màng tế bào = enzyme, tùy tế bào mà chọn. E.coli khá đơn giản nên chọn lysosome và serine protase.
3. Trong dung dịch giờ có protein và DNA. Cho phenol vào, phenol kg tan trong nước, nhưng hòa tan protein. Hút nước (có DNA) và đổ bỏ phenol => xong
P/s: Tách lý thuyết thì như thế, như khi tách để làm thí nghiệm sau (chay gel chẳng hạn) thì phải làm khác một chút để thu DNA tinh khiết hơn.
Similar threads
