Xác định hoạt tính cellulase từ Trichoderma

[hanoidep]

Mình đang làm đề tài về xác định hoạt tính của cellulase từ Trichoderma, cụ thể là 3 loại enzyme endoglucanse, exoglucanse and beta-glucoside.
Nhưng đôi khi kết quả không được ổn định. Đặc biêt khi thử exoglucanse, control thường cao hơn sample.
xin hỏi có ai đã làm thí nghiệm về đề tài này hay có ý kiến gì về lí do control cao hơn sample không.
Control mình cho đủ các chất vào, trừ mẫu và thay mẫu bằng buffer.
Còn cơ chất mình dùng để xác định exoglucanse là avicel 2%
Chân thành cảm ơn

 

[cfareast]

Endo và exo enzyme, thì bạn dùng chung 1 cơ chất CMC cũng được, việc gì dùng 2 cơ chất. Còn glucosidase thì dùng cơ chất riêng (hình như PNPG).
Mẫu bạn chưa Enzyme thô, hay đã tinh sạch?

Control bạn cao hơn mẫu thì ko chuẩn rồi. Vì control (nếu đo bằng DNS) thì màu nhạt, OD 0.2-0.3 là cùng. Mẫu OD thí nghiệm, trên dưới giá trị này thì là ko chuẩn rồi, vì hoạt tính quá yếu.
Bạn thử dùng phương pháp đục lỗ thạch + CMC, xem exoglucanase có ko đã??? rồi mới tính tiếp. Vì hoạt tính có thể quá yếu...

Còn nữa, bạn phải chạy TLC mới biết cái enzyme là endo hay exo, thì mới mạnh miệng nói được. Bạn có biết exo và endo là thế nào không?

Còn nữa, mấu control bạn làm không chuẩn!

 

[hanoidep]

Cảm ơn bạn đã trả lời
Mình đọc một số bài báo họ dùng riêng, với endo là CMC và exo là avicel . Nếu dùng chung thì mình không hiểu phân biệt thế nào?
Còn betaglucoside mình dùng pNPG, kết quả khá ổn định nhưng rất thấp.
Mẫu control đo bằng DNS của mình với CMC dao động tầm 0.11-0.12. Còn với avicel thì rất không ổn định, lúc đầu mình nghĩ tại nó insoluble nên đã khuấy kĩ trước khi sử dụng nhưng vẫn không ổn định
Mẫu của mình là enzyme thô , chỉ lấy dịch nuôi cấy rồi đem ly tâm.
Đã thử phương pháp đục lỗ thạch và xác định có hoạt tính cellulase. Chạy điện di cũng xác định được là có.

Còn control thì mình cũng có đọc tài liệu và có nơi bảo cho thêm enzyme và dùng nhiệt độ để bất hoạt trước phản ứng.
Mình có hỏi một chị cùng phòng thí nghiệm thì chị bảo mình làm vậy. Chị trước kia cũng từng làm về protein.
Thực sự giờ chỉ có mình mình làm nghiên cứu về đề tài này, người làm trước giờ cũng đã tốt nghiệp và đây cũng là lần đầu mình chuyển sang làm enzyme nên rất nhiều điều chưa rõ.
nếu được bạn có thể giải thích thêm cho mình không

 

[cfareast]

Mẫu control dùng enzyme bất hoạt là đúng rùi.

Về mẫu enzyme thô, thì thật ra ko biết trong mẫu đó có những enzyme loại gì? Bạn không thể nói là nó có enzyme endo, exo hay glucosidase được. Để kết luận được bạn phải tinh sạch, phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC, hay đơn giản bằng TLC.

Thế nào là endo, exo và glucosidase??? bạn ko thể phân biệt được endo hay exo nếu dùng cơ chất và so màu.

Bằng phương pháp điện di protein, bạn có thể biết chính xác có bao nhiêu cellulolytic enzyme, có thể tinh sạch và biết nó thuộc loại gì?



Avicel là cellulose, CMC cũng là cellulose... ko hiểu bạn dựa vào đâu mà lấy cơ chất này dùng cho endo, cái kia cho exo ???? và có thể kết luận được typ của enzyme?

Tùy thuộc đề tài của bạn là SV, master, phd hay gì đó, mà phát triển chiều sâu đề tài.

Nếu phòng bạn có những thiết bị điện di protein, thì có thể làm rất sâu được, số liệu thỏa mãn mọi kiểu đề tài.

Nếu bạn chỉ lấy dịch, làm phản ứng so màu... bạn chỉ có thể kết luận có cellulase mà thôi. Endo hay exo cũng có thể có hoạt tính glucosidase...

 

[hanoidep]

Mình cũng đọc rất nhiều bài báo và họ làm như vậy. Có bài còn ghi là đặc tính CMCase và Avicelase. Một chất solube và một chất insoluble, nói chung là cảm ứng sinh 2 loại enzyme endo và exo
Bước đầu thầy giao cho mình là xác định các điều kiện môi trường để thu được hoạt tính endo, exo và betaglucoside.
thế nhưng mình làm vài lần và kết quả ko ổn định.

 

[cfareast]

Mình cũng đọc rất nhiều bài báo và họ làm như vậy. Có bài còn ghi là đặc tính CMCase và Avicelase. Một chất solube và một chất insoluble, nói chung là cảm ứng sinh 2 loại enzyme endo và exo
Bước đầu thầy giao cho mình là xác định các điều kiện môi trường để thu được hoạt tính endo, exo và betaglucoside.
thế nhưng mình làm vài lần và kết quả ko ổn định.

Okie, 3 cơ chất cho 3 loại enzyme: CMCase, avicelase và glucosidase.

control của avicel là bao nhiêu?, Nếu nó kết tủa, thì khó đo, vì theo mình mật độ tùy thuộc vào độ lắng hay lơ lửng của avicel. Đo OD bước sóng 540nm có khi bị nhiễu bởi avicel lơ lửng.
Tốt nhất đem ly tâm và lấy dịch mà đo, chắc chắn ko sai số.
Cùng 1 mẫu avicel, bạn mang đi, làm rung lắc, đặt mạnh nhẹ, là có sai số rồi. Vì chỉ đo đường khử, nên ly tâm đo dịch nổi, là ổn nhất!

good lucks

 

[Mạch Trần Phương Thảo]

Nhân tiện mình hỏi ké cái đề tài cellulase của mình với. Mình đang làm đề phân lập chủng sinh cellulase cơ chất là CMC với đục lỗ thạch nhưng không biết dùng thuốc thử nào để dễ nhận biết với.
Mình đã dùng Lugol và test thì lugol chỉ bắt màu với tinh bột không bắt với CMC, zậy mà có nhiều bài báo VN nói xài Lugon
Có chất nhuộm màu khác là congo red với trypan blue nhưng mình kiếm ko dc. Có ai suggest gì thì giúp với.
Anyway, có bạn nào có phương pháp định lượng cellulose ko, đề tài mình mục tiêu thủy phân 20% cơ chất nên phải đo cellulose chứ k đo được đường.
Thanks,

 

[Mạch Trần Phương Thảo]

Xin lỗi có sự sai sót từ phía mình ở một số thí nghiệm chút. Bữa trước làm thì lugol bắt màu CMC thành xanh, nhưng bữa nay làm lại thì bắt màu vàng, vòng phân giải màu trắng trong đẹp.

Bữa trước làm thí nghiệm ktra tính nhuộm enzyme của lugol. Mẫu 1: CMC
Mẫu 2: CMC + EN
Mẫu 3: En

[/IMG]

CMC nhuộm lugol trong 1ph rồi đổ ra

Lúc đầu nhuộm

 

[cfareast]

Xin lỗi có sự sai sót từ phía mình ở một số thí nghiệm chút. Bữa trước làm thì lugol bắt màu CMC thành xanh, nhưng bữa nay làm lại thì bắt màu vàng, vòng phân giải màu trắng trong đẹp.

Bữa trước làm thí nghiệm ktra tính nhuộm enzyme của lugol. Mẫu 1: CMC
Mẫu 2: CMC + EN
Mẫu 3: En
[/IMG]

CMC nhuộm lugol trong 1ph rồi đổ ra



Lúc đầu nhuộm
[/QUOTE]

Lugol dùng cho tinh bột.
congo red cho CMC.

Cái này thành chuẩn rồi, bạn đừng có chế biến hay modify nữa. Khó chấp thuận và làm lệch hướng nghiên cứu của bạn.


Nhuộm lugol cho CMC có vòng, không nói rằng mẫu có hoạt tính cellulase. Đơn giản là CMC của bạn có dính tinh bột (vì đơn giản CMC ko thể tinh khiết 100%), và hoạt tính mẫu là amylase. Hoặc ví lý do hóa học nào đó, dịch mẫu của bạn khuếch tán làm lugol ko bám vào CMC, hoặc làm hỏng lugo chỗ khuếch tán, tạo phức với lugol... Nói tóm vì một lý do hóa lý nào đó, ko phải bản chất enzyme.

Cái vòng phân giải cũng ko nói lên hoạt tính cao hay thấp, chỉ là có hay ko thôi! để screening tương đối.

Còn giảm 20% cellulose, có thể tính theo đường khử, quy ra glucose...nhưng tính theo cách này sẽ làm bạn thiệt, vì độ giảm thấp. Ví dụ tạo được các oligo 10-100 gốc glucose, với trọng lượng 10-100x180 Da, nhưng tính theo đường khử chỉ là 1 gốc glucose. Kể cả enzyme thủy phân hết cellulose thành các gốc 2 glucose, 3 glucose, 4 glucose...thì hiệu suất theo đường khử cũng chỉ là 50 , 33 và 25% tương ứng.

Cách 2: đo lượng cellulose trước và sau phản ứng. Tất cả những oligosaccharides tạo thành sẽ tan trong nước, còn lại là cellulose thô, ly tâm thu hồi là xong. Cách này sẽ làm tăng % thủy phân, vì tính theo trọng lượng, chứ ko tính theo gốc đường khử.

Để chọn mục đích thủy phân cellulose, bạn nên chọn endo-enzyme. Hãy phát triển kỹ thuật TLC (sắc ký giấy). Kỹ thuật này đơn giản lắm, mà ko thể thiếu khi nghiên cứu enzyme thủy phân.

 

[Mạch Trần Phương Thảo]

Mình cũng mới phát hiện ra cái agar toàn tinh bột, lugol ko có tác dụng gì nhưng giờ chẳng biết kiếm ở đâu có congo red, hic.
VÌ hiện tại có quá nhiều chủng và để định tính cho nhanh thì cần sử dụng đục lỗ thạch chứ ngồi đợi đo chất xơ ko biết ổn ko.

 

[cfareast]

Mình cũng đoán bị nhiễm tinh bột, chỉ 1 ít cũng bắt mầu.

Test bằng so màu dùng phương pháp DNS cũng nhanh, đơn giản và chính xác... 1 ngày bạn có thể test hàng trăm mẫu, nói chung quá đơn giản, tiết kiệm ...Cơ chất là CMC cho screening.... Nếu ko có máy đọc màu, hoặc ngại đọc, thì dùng mắt thường mà chọn...Quan trọng làm control cẩn thận.

Thế thôi, chuyện nhỏ như con thỏ.

Còn cái giảm 20% cellulose, cũng rất đơn giản, chịu khó tư duy và đọc tài liệu nhé!

 

[Mạch Trần Phương Thảo]

Tuần sau sẽ có congo-red rồi nhưng cái anh làm nó thì bảo nhuộm ko ra, phải rửa = NaCl. Ảnh ở xa mà ko nói kĩ , còn tài liệu thì chỉ nói nhuộm bình thường. Có ai thử cái này chưa?

 

[cfareast]

Tuần sau sẽ có congo-red rồi nhưng cái anh làm nó thì bảo nhuộm ko ra, phải rửa = NaCl. Ảnh ở xa mà ko nói kĩ , còn tài liệu thì chỉ nói nhuộm bình thường. Có ai thử cái này chưa?

Nhuộm congo red thì cứ pha loãng 0.1-0.5%, cho ít ethanol cũng được... rồi đổ vào đĩa, có hoạt tính thì có vòng.... cực nhạy luôn, rửa nước máy cũng được, NaCL cũng được, no problem.

Còn làm với DNS cũng rất nhạy.... Nhuộm ko ra, thì là NO activity hay kỹ thuật kém.

VK có enzyme tốt, nhưng để detect được nó, cũng phải có kinh nghiệm và kiến thức... nếu ko thì bỏ sót nhiều chủng quý.

Thế thôi!...

 

[lanthanh211]

Cho mình hỏi Avicel và pNPG ở TH.Hồ Chí Minh mình có thể mua ở đâu ạ