What's new

Thí nghiệm như ma làm

Dương Văn Cường

Administrator
#1
Digest vector (purified by column) bằng BamHI và XhoI. Trong vector này đoạn TA insert đã được confirm bước đầu vì khi cắt bằng HindIII (được bố trí ở 2 mép của vị trí TA) thì đã văng ra đúng đoạn có kích thước lý thuyết. Giải trình tự đã xác định được 100bp ở giữa gene là đúng chứng tỏ đoạn insert không sai. BamHI và XhoI được treo ở 2 đầu mồi PCR.

Trên vector có 1 vị trí BamHI, vì vậy khi cắt bằng BamHI trong 4 clones có 1 clone văng ra đoạn mong muốn đồng nghĩa với việc insert gắn "ngược chiều", tức là đầu có BamHI của insert nằm khác phía với đầu có BamHI của vector. 3 clones còn lại không văng ra đoạn insert tức là đầu có BamHI của insert nằm cùng phía với đầu chứa BamHI của vector. Sử dụng 3 clones này để cắt:

1. Từng enzyme BamHI or XhoI single digest sử dụng buffer của chính enzyme đó: Cắt hoàn toàn, thu được 1 băng mạch thẳng đúng kích thước lý thuyết.

2. Từng enzyme single digest sử dụng buffer tango 2X (recommended and provided by fermentas): Cắt hoàn toàn, thu được 1 băng mạch thẳng đúng kích thước lý thuyết.

3. Double digest sử dụng tango 2X (là cái điều kiện mà khi cắt từng enzyme đã cắt hoàn toàn) và lượng BamHI gấp đôi XhoI (fermentas bẩu thế): chỉ tạo thành mạch thẳng, tức là chỉ có 1 enzyme hoạt động, chứ không văng ra đoạn insert mong muốn.

Hiện tượng lặp lại y hịt với 3 clones.

4. Tiếp tục thử 3-4 điều kiện double digest của 2 enzyme này theo gợi ý của Fermentas, tất cả đều tạo ra mạch thẳng hoặc không cắt tí nào.

5. Cắt bằng XhoI, gel elution, cắt tiếp bằng BamHI: Vẫn chỉ có 1 mạch thẳng đúng kích thước lý thuyết vector + insert.

6. Ngược lại, cắt bằng BamHI, gel elution, cắt tiếp bằng XhoI: Vẫn 1 mạch thẳng.

:botay:
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Theo mình cách đơn giản, trực tiếp, cho biết sai lầm nằm ở đâu trong thời gian nhanh nhất là sequencing dùng primer của vector.

Cái món thí nghiệm sinh học này nhiều lúc cho những kết quả ko thể lý giải nổi. Cách đơn giản trực tiếp nhất là dùng thí nghiệm khác để kiểm chứng, ngồi nghĩ đau đầu lắm, mà sau đó vẫn cứ phải... làm thí nghiệm khác!
 
Cái này mới là ma làm nè:
+ Chạy PCR genomic DNA, kiểm tra 5ul/50ul thấy băng đặc hiệu và một vài băng mờ (dùng mồi thoái hóa mà)
+ Elution bằng gel 1% ở 60V, 1 cặp mồi không còn thấy băng nữa, 3 cặp mồi kia mỗi cặp cho ra đúng 1 băng duy nhất không thấy các băng không đặc hiệu. Đã loại trừ trường hợp tràn giếng bởi kích thước của băng mất đi khác hẳn các băng ở các giếng còn lại
+ Hiện tượng mất băng đã xảy ra 3 lần, đều toàn với genomic PCR dùng degenerate primers. Loại trừ lý do labmate chơi xấu bởi luôn là người ra về sau cùng.

Một thí nghiệm ma nữa là nhuộm bạc. Cùng một kit, lặp lại đk y hệt, có lúc khoảng 10 phút development băng ra rất đẹp và đều (ra gần như cùng lần với nhau). Nhiều lúc phải để tới 1 tiếng đồng hồ băng mới ra hết.
Mẹo: khi tinh sạch xong load một lượng protein khá lớn (0.5-1ug) rồi nhuộm bạc. Stop ngay sau khi thấy băng cuả mình; đảm bảo sẽ được figure cực chuẩn cho purification data :mrgreen:
 

Cao Xuân Hiếu

Administrator
Digest vector (purified by column) bằng BamHI và XhoI. Trong vector này đoạn TA insert đã được confirm bước đầu vì khi cắt bằng HindIII (được bố trí ở 2 mép của vị trí TA) thì đã văng ra đúng đoạn có kích thước lý thuyết. Giải trình tự đã xác định được 100bp ở giữa gene là đúng chứng tỏ đoạn insert không sai. BamHI và XhoI được treo ở 2 đầu mồi PCR.

Trên vector có 1 vị trí BamHI, vì vậy khi cắt bằng BamHI trong 4 clones có 1 clone văng ra đoạn mong muốn đồng nghĩa với việc insert gắn "ngược chiều", tức là đầu có BamHI của insert nằm khác phía với đầu có BamHI của vector. 3 clones còn lại không văng ra đoạn insert tức là đầu có BamHI của insert nằm cùng phía với đầu chứa BamHI của vector. Sử dụng 3 clones này để cắt:

1. Từng enzyme BamHI or XhoI single digest sử dụng buffer của chính enzyme đó: Cắt hoàn toàn, thu được 1 băng mạch thẳng đúng kích thước lý thuyết.

2. Từng enzyme single digest sử dụng buffer tango 2X (recommended and provided by fermentas): Cắt hoàn toàn, thu được 1 băng mạch thẳng đúng kích thước lý thuyết.

3. Double digest sử dụng tango 2X (là cái điều kiện mà khi cắt từng enzyme đã cắt hoàn toàn) và lượng BamHI gấp đôi XhoI (fermentas bẩu thế): chỉ tạo thành mạch thẳng, tức là chỉ có 1 enzyme hoạt động, chứ không văng ra đoạn insert mong muốn.

Hiện tượng lặp lại y hịt với 3 clones.

4. Tiếp tục thử 3-4 điều kiện double digest của 2 enzyme này theo gợi ý của Fermentas, tất cả đều tạo ra mạch thẳng hoặc không cắt tí nào.

5. Cắt bằng XhoI, gel elution, cắt tiếp bằng BamHI: Vẫn chỉ có 1 mạch thẳng đúng kích thước lý thuyết vector + insert.

6. Ngược lại, cắt bằng BamHI, gel elution, cắt tiếp bằng XhoI: Vẫn 1 mạch thẳng.

:botay: :icon ma làm:

cái này anh đã nghe nói đến nhiều là RE của bọn Fermentas đặc biệt là FastDigest cắt plasmid khá tốt nhưng hay gặp vấn đề với việc cắt mạch thẳng. Dùng thử RE của Roche xem. Dùng các loại fast digest (ủ 5min RT /37oC) thì khá thuận tiện khi check sản phẩm nhưng để cloning và gắn nối thì nên dùng các loại ủ lâu, cắt hoàn toàn. Đặc biệt với những bọn FD thì đừng dùng các ligase công năng mạnh, dễ bị gắn các sản phẩm cắt k hoàn toàn.
 

huyenpham

New member
Re: Thí nghiệm giống như ma làm

Chào mọi người, mình là người mới. Thí nghiệm của mình bây giờ cũng như có ma, post lên để mọi người giúp đỡ. Mình phải cắt insert(600bp) từ plasmid số 1 (7kb), để clone sang 1 plasmid số 2 (cũng 7 kb). Sau double digestion với AisI và MluI thì mình chỉ thấy có plasmid 7kb trên gel mà không thấy đoạn insert đâu. Để chắc ăn, mình chạy PCR với primer ở 2 đầu của insert thì thấy là insert của mình vẫn còn nằm trong plasmid số 1. Mình sequence ra thì thấy các đầu cắt AsisI và MluI vẫn còn nguyên ko có mutation, nhưng mình ko tài nào cắt nó ra dc. Mình đã thử với các cặp enzyme khác vì plasmid đó chứa khá nhiều điếm cắt (AsisI và MluI, AsisI và XhOI, AsisI và PmEI nhưng ko thu được insert. Điều làm mình ngạc nhiên là chỉ vài tháng trước, cùng plasmid đó, mình cắt insert ra rất dễ.
Mình đã purify lại plasmid, thay bufer , làm rất nhiều thứ nhưng vẫng ko ra gì cả. Digestion enzyme thi còn hạn dùng nên sếp mình ko đồng ý mua cái mới. Mình dùng của New Bio England. Bây giờ mình phải làm sao?
 
Em chào các Anh!
Em gặp một vấn đề như sau: sau khi tách chiết và tiến hành pcr thành công. Kết quả điện di xuất hiện Band DNA (400bp) như ý rồi. Nhưng sản phẩm PCR còn dư em bảo quản trong tủ lạnh (-29 độ C) sau 3 tuần đem điện di lại thì không xuất hiện BAND DNA nữa( đen thui). còn thang thì bình thường.

Em không hiểu lý do vì sao như thế nữa. Các Anh giải thích dùm em với.

Thanks!
 

Dương Văn Cường

Administrator
Chào mọi người, mình là người mới. Thí nghiệm của mình bây giờ cũng như có ma, post lên để mọi người giúp đỡ. Mình phải cắt insert(600bp) từ plasmid số 1 (7kb), để clone sang 1 plasmid số 2 (cũng 7 kb). Sau double digestion với AisI và MluI thì mình chỉ thấy có plasmid 7kb trên gel mà không thấy đoạn insert đâu. Để chắc ăn, mình chạy PCR với primer ở 2 đầu của insert thì thấy là insert của mình vẫn còn nằm trong plasmid số 1. Mình sequence ra thì thấy các đầu cắt AsisI và MluI vẫn còn nguyên ko có mutation, nhưng mình ko tài nào cắt nó ra dc. Mình đã thử với các cặp enzyme khác vì plasmid đó chứa khá nhiều điếm cắt (AsisI và MluI, AsisI và XhOI, AsisI và PmEI nhưng ko thu được insert. Điều làm mình ngạc nhiên là chỉ vài tháng trước, cùng plasmid đó, mình cắt insert ra rất dễ.
Mình đã purify lại plasmid, thay bufer , làm rất nhiều thứ nhưng vẫng ko ra gì cả. Digestion enzyme thi còn hạn dùng nên sếp mình ko đồng ý mua cái mới. Mình dùng của New Bio England. Bây giờ mình phải làm sao?
Bạn làm single digest với từng enzyme riêng biệt trong điều kiện buffer chuẩn của enzyme đó.

- Nếu OK thì làm single digest enzyme 1 -> elute -> single digest enzyme 2.

- Nếu không OK thì cũng xác định được enzyme nào có vấn đề và có cơ sở để khắc phục.
 

Dương Văn Cường

Administrator
Em chào các Anh!
Em gặp một vấn đề như sau: sau khi tách chiết và tiến hành pcr thành công. Kết quả điện di xuất hiện Band DNA (400bp) như ý rồi. Nhưng sản phẩm PCR còn dư em bảo quản trong tủ lạnh (-29 độ C) sau 3 tuần đem điện di lại thì không xuất hiện BAND DNA nữa( đen thui). còn thang thì bình thường.

Em không hiểu lý do vì sao như thế nữa. Các Anh giải thích dùm em với.

Thanks!
Chắc là ma đói quá ăn mất rồi :mrgreen:

Đùa thôi, trường hợp này có lẽ do trong mẫu có DNase. PCR lại thôi.
 
Chắc là ma đói quá ăn mất rồi :mrgreen:

Đùa thôi, trường hợp này có lẽ do trong mẫu có DNase. PCR lại thôi.
Tại em nghĩ Ở -29 độ C thì DNase không hoạt động được nên không hiểu tại sao mẫu DNA của em biến mất. Chắc rồi. Con ma DNase này xơi mất vào ngày cúp điện cũng nên.

May mà chưa gửi nó đi giải trình tự.

Cảm ơn anh Cường nhiều!
 

huyenpham

New member
Bạn làm single digest với từng enzyme riêng biệt trong điều kiện buffer chuẩn của enzyme đó.

- Nếu OK thì làm single digest enzyme 1 -> elute -> single digest enzyme 2.

- Nếu không OK thì cũng xác định được enzyme nào có vấn đề và có cơ sở để khắc phục.
Hi bạn, mình làm sequential digestion đó chứ. 1 digest with AsisI/NE bufer 4--> elute --> 2 digestion với MluI/NE bufer 3. Sau 2 lần digest thì chạy gel --> ko thấy cái ínertt đau. Vậy theo bạn mình phải suy ra cái enzyme nào hư???
 
Em cũng gặp trường hợp này mà chưa giải thích được. Anh chị nào có kinh nghiệm vào giúp đỡ nhé:)
1. Plasmid sau khi biến nạp, đem cắt bằng hai enzyme đã dùng để cắt và nối gen, thì thu được đoạn 2,5 kb văng ra thay vì 1,1kb là kích thước gene chèn vào.
2. Một vấn đề nữa, ở một tn khác, plasmid tách được ra cứ động cho enzyme cắt hạn chế vào là bị phân hủy sạch, thành một dải mờ mờ ảo ảo, không nhìn ra band nữa. Mà đem tinh sạch bằng cột hay cô đặc bằng cột thì mất hết, điện di không thấy gì cả. Liệu có phải plasmid ấy k phải plasmid mà là genome hay cái gì khác??
Thân!
 

cfareast

Member
Em cũng gặp trường hợp này mà chưa giải thích được. Anh chị nào có kinh nghiệm vào giúp đỡ nhé:)
1. Plasmid sau khi biến nạp, đem cắt bằng hai enzyme đã dùng để cắt và nối gen, thì thu được đoạn 2,5 kb văng ra thay vì 1,1kb là kích thước gene chèn vào.
2. Một vấn đề nữa, ở một tn khác, plasmid tách được ra cứ động cho enzyme cắt hạn chế vào là bị phân hủy sạch, thành một dải mờ mờ ảo ảo, không nhìn ra band nữa. Mà đem tinh sạch bằng cột hay cô đặc bằng cột thì mất hết, điện di không thấy gì cả. Liệu có phải plasmid ấy k phải plasmid mà là genome hay cái gì khác??
Thân!
Tất cả trường hợp sai, lỗi... đều do con người, do trình độ, kỹ thuật non kém, do bất cẩn...

Trường hợp 1: bạn chọn dòng, nên chọn 5-7 clones... cắt kiểm tra plasmid và lấy 1 clone chuẩn. Vì đơn giản, plasmid vào cơ thể, nó bị trao đổi, bị đột biến, bị gì gì nữa, có trời mới biết. Thế nên bao giờ cũng chọn vài dòng đem kiểm tra, lấy 1 dòng ổn định và đúng... Cắt nếu nghi ngờ, thì dùng enzyme hãng khác, lọ khác... cắt plasmid khác....
Hoặc có thể đơn giản chỉ là cái insert có đúng nó ko? hay vớ phải lọ khác???

Trường hợp 2: Cái plasmid bị cắt sạch.... Có nhiều cách giải thích... Nhưng người làm đầu tiên phải sure nó là plasmid, kích thước... và làm gì cũng phải có đối chứng với plasmid khác, enzyme chuẩn chưa? có bị tạp không? nước cất sạch chưa???? Có lấy đúng plasmid không? Đã ai chọc lung tung pipet vào lọ enzyme chưa????
Trước khi cắt, có điện di kiểm tra thử plasmid chưa???

Nói tóm lại là về phía người làm phải sure tất cả... và nếu kết quả ko đúng, thì lại phải xem lại mình!
 
Tất cả trường hợp sai, lỗi... đều do con người, do trình độ, kỹ thuật non kém, do bất cẩn...

Trường hợp 1: bạn chọn dòng, nên chọn 5-7 clones... cắt kiểm tra plasmid và lấy 1 clone chuẩn. Vì đơn giản, plasmid vào cơ thể, nó bị trao đổi, bị đột biến, bị gì gì nữa, có trời mới biết. Thế nên bao giờ cũng chọn vài dòng đem kiểm tra, lấy 1 dòng ổn định và đúng... Cắt nếu nghi ngờ, thì dùng enzyme hãng khác, lọ khác... cắt plasmid khác....
Hoặc có thể đơn giản chỉ là cái insert có đúng nó ko? hay vớ phải lọ khác???



Nói tóm lại là về phía người làm phải sure tất cả... và nếu kết quả ko đúng, thì lại phải xem lại mình!
Cần phải nói rõ hơn là em đang tạo plasmid tái tổ hợp chứ không phải tách một cái gene đã được chèn vào một plasmid có sẵn, vì vậy đang check sản phẩm. Em đang muốn biết cái đoạn 2,5 kb kia là cái gì, ở đâu ra.
Muốn hỏi thêm các anh chị một vấn đề nữa, khi tách dòng mà sử dụng enzyme cắt đầu bằng, sau đó dùng ligase rất mạnh để nối, liệu có xảy ra trường hợp nối hai gen vào một plasmid không?
 

cfareast

Member
Đương nhiên là cắt đầu bằng khi nối lại sẽ có các đoạn chứa 1 gen, 2 gen ... và nxgen. Tuy nhiên, hiệu suất lai, và biến nạp thì đoạn chứa 1 gen vẫn nhiều hơn, nên xac suat chọn insert là 1 gen vẫn nhiều hơn nhiều.
(tôi chỉ Suy luận từ lý thuyết)
 
Đương nhiên là cắt đầu bằng khi nối lại sẽ có các đoạn chứa 1 gen, 2 gen ... và nxgen. Tuy nhiên, hiệu suất lai, và biến nạp thì đoạn chứa 1 gen vẫn nhiều hơn, nên xac suat chọn insert là 1 gen vẫn nhiều hơn nhiều.
(tôi chỉ Suy luận từ lý thuyết)
Mình lại muốn biết thực nghiệm đã ai gặp như vậy chưa?
 
Trường hợp 2 insert ligase với nhau rồi ligase vào vector là cực kỳ thấp bạn ạ.
Trường hợp của bạn thì nên làm lại phản ứng biến nạp, rồi screen colonies bằng onestep miniprep như tôi đã mô tả trong forum. Trước hết bạn screen vài chục colony bằng size. Sau đó nếu cắt thử 1 positive colony mà đúng kích thước thì dừng. Nếu không bạn tiếp tục làm onestep miniprep bằng enzyme cắt hạn chế cho tới khi tìm được colony cắt ra insert đúng với kích thước bạn muốn.
 
one-step miniprep của anh là như thế này đúng không:
+ lấy khoảng 400 ul dịch nuôi
+ ly tâm 2 phút top-speed thu tế bào
+ Cho 20 ul PCI và 40 ul 6xloading buffer vào
+ Vortex 1 phút
+ Ly tâm 10 phút
+ Hút 10 ul dịch nổi đem điện di để quan sát nồng độ plasmid của bạn.
Mục đích theo em hiểu là tách plasmid nhanh nhằm xem kích thước bao nhiêu (hoặc đem so sánh với plasmid gốc), chọn ra clone nghi là đã chèn gene. Nhưng khi chưa cắt thì xác định kích thước dựa vào Marker ladder thì không được, mà để làm các bước tiếp theo như cắt bằng enzyme, PCR thì lại vẫn phải nuôi lại tách lại.
Còn PCI là gì ạ, thành phần thế nào?
Với cả hơi tốn loading buffer nữa, k biết cái này có rẻ k:)
 
Bạn có thể làm như thế này:
Nuôi như trên nhưng khoảng 1 ml
Lấy 400 ul để làm minprep size check. Cái này khá là trực quan: insert của bạn nếu kích thước kha khá một chút (>0.3 kb) thì plasmid có insert sẽ trồi lên 1 chút so với plasmid không có insert (đối chứng).
Trong mấy candidate mà bạn chọn được (size trên gel đều tăm tắp và nhỉnh hơn plasmid không một chút), bạn dùng 600 ul còn lại và làm miniprep restriction digestion.
 

Biologist

Member
Bạn Hồng Nhung:

Nếu như Bạn không quen làm "screening" như Bạn Lương chỉ dẫn thì nếu phòng thí nghiệm của Bạn có điều kiện thì Bạn nên dùng phương pháp colony-PCR: rất nhanh (không cần phải chuẩn bị overnight cultures), có thể "screen" được rất nhiều colony cùng một lúc, và có thể biết được kích thước của inserts khá chính xác.

Chúc thành công,
 

Facebook

Top