Tại sao PCR không hiệu quả?

#1
Em đang gặp rắc rối trong bước đơn giản nhất là PCR, các anh chị giúp em giải quyết nhé.
Em thực hiện PCR mồi đặc hiệu câu một gene 1,1 kb từ B. subtilis. Đầu tiên nuôi chủng trên LB, tách thu DNA, điện di một band sáng, độ tinh sạch A260/280 = 1,9. Nồng độ DNA đo bằng nanodrop khoảng 100 ng/ul. Thực hiện PCR với các dải nhiệt độ khác nhau, dùng Mastermix 2X của Thermo, thử với các nồng độ pha loãng khuôn từ 1 - 1/50.
Kết quả: phản ứng PCR có lúc không lên, có lên cũng chỉ là một band lờ mờ đủ để nhận biết khi chạy với nồng độ pha loãng khuôn DNA 1/5; 1/10.
Em muốn hỏi các anh chị xem tại sao lại như vậy và nếu sản phẩm PCR mờ như vậy có thể dùng tiếp để tách dòng được không?
 
Last edited:

cfareast

Member
Em đang gặp rắc rối trong bước đơn giản nhất là PCR, các anh chị giúp em giải quyết nhé.
Em thực hiện PCR mồi đặc hiệu câu một gene 1,1 kb từ B. subtilis. Đầu tiên nuôi chủng trên LB, tách thu DNA, điện di một band sáng, độ tinh sạch A260/280 = 1,9. Nồng độ DNA đo bằng nanodrop khoảng 100 ng/ul. Thực hiện PCR với các dải nhiệt độ khác nhau, dùng Mastermix 2X của Thermo, thử với các nồng độ pha loãng khuôn từ 1 - 1/50.
Kết quả: phản ứng PCR có lúc không lên, có lên cũng chỉ là một band lờ mờ đủ để nhận biết khi chạy với nồng độ pha loãng 1/5; 1/10.
Em muốn hỏi các anh chị xem tại sao lại như vậy và nếu sản phẩm PCR mờ như vậy có thể dùng tiếp để tách dòng được không?
PCR có lúc lên, lúc không, thì chứng tỏ là phản ứng PCR thành công (lên vạch rồi).

Còn lúc không, lúc lờ mờ... chứng tỏ người làm phản ứng không kỹ càng, cẩn thận nên phản ứng hỏng. Ở đây làm không tốt có thể gặp ở các thao thác mix mẫu, hút mẫu, lẫn run gel.

PCR lờ mờ, thì vẫn cứ tách dòng được. Tuy nhiên, bạn phải làm nhiều lên, vất vả hơn và cẩn thận hơn... Còn tùy thuộc thao tác của bạn có chuẩn không.

Bạn phải nhớ từ lúc PCR đến lúc trải đĩa, chọn dòng.. v.v có rất nhiều khâu... và khâu nào cũng quan trọng, kể cả ly tâm chuẩn bị tế bào khả biến... chuẩn bị vector, cắt enzyme....

Nếu mẫu PCR ít. thì nên biến nạp xung điện thì vào nhiều hơn. Tuy nhiên, khâu xung điện cũng cần có kinh nghiệm...
 
Last edited:
Chắc chắn không phải do thao tác rồi, vì lặp đi lặp lại kết quả vẫn thế, thay người khác làm cũng vậy. Em nghĩ đau đầu mà không hiểu tại sao rồi :( Nguyên nhân nhiều nhất chỉ có thể là mồi hoặc khuôn. Hoặc cái gen cần tách nó biến đi đâu mất rồi. Liệu có phải do sử dụng chủng B. subtilis cấy chuyển quá nhiều lần rồi không?
 
Nghi ngờ ở đâu thì trả lời ở đấy bằng thực nghiệm thôi: Nghi ngờ do mồi thì chạy đối chứng dương, nghi ngờ do chất lượng DNA thì chạy đối chứng nội (internal control).

Nhiều yếu tố có thể ức chế phản ứng PCR: Không loại hết phenol và ethanol/iso propanol từ bước tách chiết DNA, nồng độ DNA khuôn quá cao hoặc quá thấp, chất lượng taq và các thành phần trong mastermix. Và câu trả lời cuối cùng bao giờ cũng đến từ thực nghiệm ;-)
 
Nghi ngờ ở đâu thì trả lời ở đấy bằng thực nghiệm thôi: Nghi ngờ do mồi thì chạy đối chứng dương, nghi ngờ do chất lượng DNA thì chạy đối chứng nội (internal control).

Nhiều yếu tố có thể ức chế phản ứng PCR: Không loại hết phenol và ethanol/iso propanol từ bước tách chiết DNA, nồng độ DNA khuôn quá cao hoặc quá thấp, chất lượng taq và các thành phần trong mastermix. Và câu trả lời cuối cùng bao giờ cũng đến từ thực nghiệm ;-)
Anh giải thích rõ hơn "Chạy đối chứng nội và đối chứng dương" cho em được không.
Em chạy 16s vẫn lên bình thường, tuy không được sáng rõ. Mastermix thì trong phòng anh chị làm đề tài khác vẫn lên.
 

vu.hai

Member
- Bạn thử kiểm tra một số thứ sau:

1. Nồng độ cuối cùng của các thành phần trong PCR mix

2. PCR tại các nhiệt độ khác nhau

- Trong trường hợp không khá hơn mà thiếu thời gian thì tách dòng luôn. Mà sản phẩm PCR "lờ mờ" của bạn có nồng độ ước lượng khoảng bao nhiêu?
 
Mình đã chạy gradient nhiệt độ, không có sự khác biệt nhiều ở các giải nhiệt độ khác nhau.
Ảnh đính kèm là sản phẩm PCR mình thu nhận được đó (bên cạnh marker), load 5ul/giếng. Dựa vào marker thì suy đoán nồng độ PCR vào khoảng 20ug/ul. Vậy có đủ dùng bước cắt enzyme giới hạn tiếp theo không?
 

Attachments

vu.hai

Member
Mình đã chạy gradient nhiệt độ, không có sự khác biệt nhiều ở các giải nhiệt độ khác nhau.
Ảnh đính kèm là sản phẩm PCR mình thu nhận được đó (bên cạnh marker), load 5ul/giếng. Dựa vào marker thì suy đoán nồng độ PCR vào khoảng 20ug/ul. Vậy có đủ dùng bước cắt enzyme giới hạn tiếp theo không?
Theo mình bạn làm song song mấy thứ này xem thế nào:

1. Liga sản phẩm PCR vào vector nhân dòng nào đó như TA hay pJET, chọn loại phù hợp với polymerase bạn dùng > xử lý bằng RE để thu insert

2. PCR lượng lớn, vd: 300-500ul, vì mình không rõ hiệu suất thu hồi DNA của kit bạn dùng thế nào > tinh sạch để làm giảm thể tích > xử lý RE > tinh sạch thu insert

3. PCR lại tiếp và thử cho nhiều khuôn lên gấp 2, gấp 4 điều kiện ban đầu
 

cfareast

Member
Mình đã chạy gradient nhiệt độ, không có sự khác biệt nhiều ở các giải nhiệt độ khác nhau.
Ảnh đính kèm là sản phẩm PCR mình thu nhận được đó (bên cạnh marker), load 5ul/giếng. Dựa vào marker thì suy đoán nồng độ PCR vào khoảng 20ug/ul. Vậy có đủ dùng bước cắt enzyme giới hạn tiếp theo không?
2 band PCR của bạn thế là tốt rồi. Bạn cứ pcr khoảng 100-200 ul thì có mà cắt enzyme hay ligation thoải mái, miễn là các bước sau bạn thao tác tốt.
 
Cái vấn đề này, trong trường hợp của mình, đơn giản là do enzyme taq hoạt động không hiệu quả. Thường thì master-mix chỉ sử dụng được trong thời gian ngắn và không được tốt bằng sử dụng taq riêng, và còn phụ thuộc hãng nữa. Hai nữa là tùy thuộc vào khuôn và mồi mà phản ứng PCR dễ hay khó, do đó không thể dựa vào kết quả người cùng phòng cũng dùng tag ấy lên mà mình lên kém là kết luận khuôn hoặc mồi của mình chưa chuẩn bị tốt. Rồi lại mất công đi tách lại khuôn, pha lại mồi :)
Chúc bạn nào gặp phải vấn đề giống mình tìm được nguyên nhân nhé :)
 
Theo kinh nghiem cua minh, ban chi can khoang 2.5-5ug cleaned insert/50-100ul de lam digestion. Sau khi gel extract, clean up, ban con lai it nhat 500ng-1ug. Neu dilute trong 20ul thi se co nong do (cua insert da xu li) it nhat 25-50ng/ul. Nong do nhu vay du suc lam ligation
 
Hồi đó mình dùng bộ kit cloning, sử dụng một vector nhỏ, blunt 2 đầu nên chỉ cần dùng 1 ul của sản phẩm PCR, xử lý với enzyme blunt để ligation đã lên rất nhiều khuẩn lạc rồi. Sau đó thích đem cái vector đó đi cắt ghép gì sang vector khác cũng đơn giản.
Đó là giải pháp cloning mà mình thấy khá hiệu quả, không cần nhiều sản phẩm PCR, không phải làm đi làm lại cắt enzyme - tinh sạch - ligation - biến nạp : )
 

sury

New member
cho e hỏi e pcr mấy lần rùi ạ
lần 1 e pcr k ra kết quả, lần 2 e đổi nhiệt độ gắn mồi cho ra 2 băng nhưng rất mờ
sau đó e pcr lại theo đúng chu kì lần 2 lại k cho ra kết quả băng nào nữa
e đã làm lại mấy lần đều k ra
 

Facebook

Top