Realtime PCR: Hỏi đáp

nvhung

Member
Phản ứng PCR đinh danh vsv thì yếu tố nào là quan trọng nhất
a. Thiết bị KT đời mơi
b. Mồi đặc hiệu
c. Chủng giống thuân khiết
d. Ca 3 ý trên
Theo mình là B, bạn nghĩ sao????:)
Theo mình primer đặc hiệu là quan trọng nhất.
Thiết bị không cần phải đời mới hay quá hiện đại miễn là sài được là ok.
 

lovekieu

Member
Vì tùy theo thiết bị của từng hãng mà " Melt curve peak" có thể lệch nhau khoảng 0.5 tới 1.0 độ C. Vì vậy nếu không cẩn thận và có kinh nghiệm dễ đưa ra kết luận không hợp lý khi làm thí nghiệm trên thiết bị của hãng này rồi sau đó chuyển giao ứng dụng lại chạy trên thiết bị của hãng khác.

Đấy là bạn sử dụng công nghệ hóa chất SyberGreen thì họ mới dùng Melt curver peak để định lượng cũng như định tính AND.

Real time PCR hiện giờ được sử dụng nhiều nhất là trong y tế, nếu các bạn ai mà đi viêm gan B, các bạn sẽ được các bác sỹ gợi ý đi làm định lượng HBV-DNA. thực chất đây là một quá trình định lượng số đoạn AND của virut viêm gan B đang có ở trong máu bệnh nhân. ngày trước họ thường dùng hóa chất là SybrGreeb cho rẻ, nhưng hóa chất này độ chính xác cũng như đặc hiệu không cao khi sử dụng nhiều mồi (probe). Hiện nay ngừoi ta sử dụng hóa chất taqman có ưu điểm là độ nhậy cao có thế định lượng được từ 1 bản copy (đoạn ADN) trong mẫu nhưng lại rất đắt.
 
Xin chào cả nhà,
Cả nhà chỉ cho mình cách tính số bản DNA có trong một khối lượng nhất định, ví dụ như trong 100ng chảng hạn. Mình đang chuẩn bị positive control sample để xây dựng đường chuẩn trong real time PCR.
 
Chào các anh chị, hiện em cũng đang làm realtime xác định GMO.
Em thiết kế phản ứng duplex xđ cả 35s lẫn T-nos nhưng điều khó hiểu là, khi em chạy phản ứng ở các nồng độ %GM khác nhau thì các đường cong khuếch đại của 35s có phân cách với nhau, nhưng riêng thằng T-nos thì vẫn chụm lại. Vậy nguyên nhân là gì? Các anh chị có thể giúp em hiểu rõ hơn được ko ah?
 
Sản phẩm của phản ứng Reverse transctription sẽ được dùng làm template cho một số phản ứng Realtime PCR. Ngoài cDNA vừa được tổng hợp, còn bị lẫn enzyme reverse transcriptase, được biết là ức chế hoạt động của phản ứng PCR. Vậy theo các bạn sự ức chế này có ảnh hưởng như thế nào đến độ chính xác trong việc định lượng của Realtime PCR. Và làm thế nào để khắc phục nó nếu điều này thực sự ảnh hưởn đến độ chính xác.
Anh ah, cái sản phẩm này có ức chế đến phản ứng RT_PCR, như lab của em thì sau khi tổng hợp cDNA, bất hoạt enzyme ở 65° và sau đó em tin sạch cDNA bằng bi thủy tinh và dung dịch tinh sạch, như vậy thì loại bỏ được enzyme và các nucleotit anh ah,
 

heo tròn

New member
Chào các anh, các chi và mọi người.anh chị nào có thể chỉ cho em biết về biểu đồ chuẩn và biểu đồ khuyếch đại trong Real-time PCR k ạ?
Em cảm ơn nhiều!
 

khoics11

New member
Chào các anh, các chi và mọi người.anh chị nào có thể chỉ cho em biết về biểu đồ chuẩn và biểu đồ khuyếch đại trong Real-time PCR k ạ?
Em cảm ơn nhiều!
Biểu đồ chuẩn có trục hòanh là số lượng DNA ban đầu bạn cho vào những phản ứng chuẩn (thường gọi tắt là standard), trục tung là giá trị Ct thu được từ những phản ứng chuẩn này. Đường thẳng xuất hiện trên biểu đồ này được gọi là đường chuẩn.
Biểu đồ khuyếch đại thể hiện sự nhân bản của các phản ứng real-time PCR. Trục hòanh là số chu kỳ PCR, trục tung thường là cường độ hùynh quang thu được từ ống phản ứng.
 

Inuyasha

Member
mọi người cho mình hỏi tí,trong realtime-PCR,việc chỉnh lại đường standard (hệ số tuyến tính,hệ số sốc Slope...) trước mỗi lần là như thế nào? vì chị hướng dẫn mình nói mình tìm hiểu mà chị ấy nói cái này cần kinh nghiệm nên khó giải thích..
và ai đó có thể nói cho mình biết hiện giờ bộ kit PCR có các lọ dung dịch (plex 1-5) lần lượt là các chất gì ko?
 

Hangmaihoa

New member
Thành viên mới xin chào mọi người ạ
Cho em hỏi là có bác nào xét nghiệm ADN hài cốt chưa ạ, cho em học hỏi kinh nghiệm với.
Em thấy cũng có vấn đề liên quan đến Realtime PCR nên em nghĩ đã cso tiền bối ứng dụng trong licnhx vực này, mong các tiền bối giúp đỡ .
 
Dạ. Em mới làm PCR nhưng không chuyên về nó. Chỉ là được học qua người khác chỉ ( kiểu giống cầm tay chỉ việc đó ạ). Nhưng nghe nói PCR độc lắm nên rất lo lắng. Em làm cũng cố gắng cẩn thận. Nhưng vẫn không yên tâm (do tâm lý là con gái sợ sau này sinh con này nọ). Bên em hiện không sử dụng EtBr nữa mà dùng safeview của Canada ạ. Vậy Anh chị nào cho e lời khuyên về cách làm, những mối nguy hiểm về hoá chất, cách bảo hộ cho bản thân không ạ. Bên e dùng PCR chứ không dùng Realtime PCR nơi ạ. Mong được chia sẻ, em cám ơn nhiều ạ!!!
 

HANG AJ

New member
(y)(y)
Threshold cycle (Ct) là một yếu tố quan trọng trong Real Time PCR. Định nghĩa của Ct là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua (cross) giá trị threshold.

Vậy, cần hiểu threshold là cái gì :D

Real Time PCR được dùng để định lượng với 1 độ chính xác cực kỳ cao. Do đó, việc đo tín hiệu huỳnh quang (là giá trị đại diện của nồng độ DNA mạch kép trong phản ứng) phải được tiến hành thật chuẩn.

Để làm được điều này cần thiết phải có một hệ đệm được thiết kế để ổn định các điều kiện. Trong hệ đệm này (do nhà sản xuất cung cấp) có một chất làm đối chứng (Passive reference). Khi đo tín hiệu huỳnh quang của reporter, máy sẽ dựa trên tín hiệu của Passive reference. Giá trị thương số khi lấy Cường độ tín hiệu huỳnh quang reporter chia cho cường độ tín hiệu huỳnh quang Passive reference được ký hiệu là Rn.

Threshold được định nghĩa là độ lêch chuẩn trung bình của giá trị Rn trong các chu kỳ đầu của PCR.

Để hiểu đúng hoàn toàn cách tính toán, cách xử lý ... của Real time là rất khó. Nên hiểu theo quan điểm của nhà sinh học, với tư cách người sử dụng công nghệ.

Ý nghĩa của Threshold và Threshold cycle:

- Threshold là điểm bắt đầu của sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang.
- Ổn định: Trong các chu kỳ đầu của phản ứng PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang thay đổi lên xuống thực chất chỉ là "nhiễu". Threshold cycle và Baseline phải được đặt sao cho máy Real Time "không thèm chấp" các tín hiệu nhiễu này.
- Xác định giá trị Ct sao cho đúng đồng nghĩa với việc tìm được điều kiện phù hợp nhất, đúng đắn nhất để đo cường độ huỳnh quang.
 

Facebook

Top