PCR problem: Caldariomyces fumago

[Trần Hoàng Dũng]

TO HÀ,

Tui thành thật xin lỗi là đã mang vấn đế bạn hỏi ra trước bàn dân thiên hạ, đơn giản là khi tui reply cho bạn, forum cho biết

Thông báo
?
Không có tên người nhận trong danh sách thành viên
?

Chào anh Dũng,

Em mới vào diễn đàn thôi. Em hiện đang làm PCR trên nấm, không chạy, định vào diễn đàn hỏi, nhưng thấy cũng đã có người thắc mắc như thế rồi, và được biết là anh cũng đã từng làm cà ngàn PCR như anh nói, nên em viết hỏi anh riêng, đỡ mất công tạo thêm một cái topic thừa trên diễn đàn.

Nấm em đang sử dụng là Caldariomyces fumago. Em lấy mẫu từ culture, sau đó đem rửa qua nước vài lần và cuối cùng là cho vào sonifier để phá hủy tế bào, cốt là chỉ lấy DNA thôi. Sau đó, em đem nấu 95°C 20', rồi đem ra sử dụng cho PCR. ?

Máy PCR ở chỗ em là loại Gradient Cycler, em thử các nhiệt độ bắt cặp khác nhau, lúc thì 45-55°C, lúc thì 50-70°C, em dùnh cả Touchdown-HotStart-PCR mà vẫn không có kết quả. Người hướng dẫn em cách đây một năm cũng làm với loại nấm này, cũng cách như em vừa kể trên thế mà được. Tóm lại, em cũng không biết tại sao PCR không chạy nữa. Nếu nói là phương pháp sai sao có người làm được (người hướng dẫn em đã làm được). Còn nồng độ thì em vẫn thường làm PCR với nồng độ như thế, chẳng bào giờ bị làm sao cả.

Anh nghe kể bệnh rồi, với kinh nghiệm làm PCR nhiều, anh có thể tiết lộ vài "bí quyết" được không?

Cảm ơn anh trước.

Hà.

Tui đang suy nghĩ bệnh của bạn rất có thể là do kỹ thuật tách DNA chưa ổn.

Nhưng mà tui khuyên bạn cứ mạnh dạn mang vấn đề ra trước SHVN, sẽ có nhiều người cùng giúp, riêng bản thân tui hứa sẽ tra cứu vấn đề để giúp bạn mau tìm biện pháp khắc phục.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Bạn kiểm tra lại hóa chất chưa? Sau 1 năm với tình trạng mất điện thường xuyên ở VN thì không gì đảm bảo cả.

Có đối chứng dương không?

 

[Vũ Hải Chi]

Bác post ảnh điện di ADN tổng số lên em xem cái, chắc tại hóa chất thôi!

 

[Trần Hoàng Dũng]

có mấy ý sau em cố gắng làm rõ::


01- Khi em nói là thầy hướng dẫn em làm ra kết quả, vậy thì thầy em có làm cùng 1 chủng nấm, 1 gene cần phân lập, một quy trình tách DNA, một PCR protocol????


02- Khi tui làm PCR kô ra, có những bước sau tui sẽ hiệu chỉnh theo thứ tự ưu tiên là:

- Bỏ các hóa chất đang sử dụng, lấy cái mới như nước cất, buffer, dNTP, pha mới primers, ?nếu vẫn kô ra thì thay luôn enzyme (chú ý enzyme và buffer đi kèm phải tương thích.

- Kô ra nữa thì quay lại DNA, kiểm tra độ tinh sạch bằng cách chạy điện di ?kô cần có ladder, nếu DNA tinh sạch thì nó ra 1 band sáng như phage lamda, kô có vệt smear đồng thời do OD để coi DNA concentration, nếu cần thiết thì vứt DNA và tách lại, chú ý coi kỹ protocol, ở bước này kô cần chạy PCR mà chỉ cần chạy diện di và do OD để coi DNA có thật sự sạch kô, khi nào thây nó thật sạch hãy quay lại chạy PCR. Cần chú ý là các thông số hóa chất nên xem xét kỹ lưỡng và giữ hằng định thậm chí của primer cũng kô đổi, bạn chỉ nên điều chỉnh DNA concentration thôi.

- Đến đây mà nó vẫn lì lợm kô ra thì bắt đầu hiệu chỉnh PCR programe.Lưu ý rằng PCR programe thường được set up ngay từ đầu dựa trên nhiệt độ Tm của primer mà ta có được. Nếu bạn có máy PCR mà chạy được gradient nhiệt độ là quá tốt, mỗi khoảng cách nửa độ là ok.

- Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer.

- Nếu vẫn kô ra thì có hai hướng giải quyết:

a- báo cáo là gene cần tìm kô có trong genome hoặc nó bị cắt ngắn nên kô chạy PCR được.
b- Dng Westernblot để dò tìm protein của nó để xác lập rằng gene này có tồn tại trong gene hay không, sau đó tách mRNA của nó và chạy PRC ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Chút nữa về viết tiếp.

 

[Cao Xuân Hiếu]

- Nếu vẫn kô ra thì có hai hướng giải quyết:

a- báo cáo là gene cần tìm kô có trong genome hoặc nó bị cắt ngắn nên kô chạy PCR được.
b- Dng Westernblot để dò tìm protein của nó để xác lập rằng gene này có tồn tại trong gene hay không, sau đó tách mRNA của nó và chạy PRC ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Chút nữa về viết tiếp.

1. Đến cả PCR còn chưa nhân lên để sequencing được thì làm cách nào tiến hành Westernblot đây?

2. Mới chỉ thế mà đã báo cáo gene ko có trong genome thì thật ai dám tin. Cùng lắm là báo cáo tôi đã PCR bằng ? cặp primer trình tự như sau mà ko có sản phẩm thôi.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Kể cả khi không lên được PCR hay lên PCR không đúng cái mình cần hoặc Westernblot cho âm tính thì vẫn chưa kết luận được genome không có gene đó. Các bác xem lại cái thí nghiệm về gene điều khiển chu trình tế bào của thằng Paul Nurse được Nobel ấy. Đúng không nhỉ?

"What's more, Lee had already failed to identify the human gene by the more conventional means of hybridization using probes for the pombe gene or using antibodies that recognized the pombe protein"

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

"Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer"
Chắc bác Dũng bảo Hiếu coi lại cái này chứ không phải là coi lại sách vở. Ý là đặt lại primer mới, thiết kế lại primer...x n lần mà vẫn không ra thì phải chịu thôi --> phương pháp PCR không cho ra kết quả--> tìm phương pháp khác.
Mà không câu ra được gene vẫn chạy Western blot bình thường mà, vì chắc chắn khi câu gene thì gene này phải thuộc họ nào, tính chất thế nào ở các loài khác đã biết rồi, đúng không nhỉ?

 

[Trần Hoàng Dũng]

"Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer"
Chắc bác Dũng bảo Hiếu coi lại cái này chứ không phải là coi lại sách vở. Ý là đặt lại primer mới, thiết kế lại primer...x n lần mà vẫn không ra thì phải chịu thôi --> phương pháp PCR không cho ra kết quả--> tìm phương pháp khác.
Mà không câu ra được gene vẫn chạy Western blot bình thường mà, vì chắc chắn khi câu gene thì gene này phải thuộc họ nào, tính chất thế nào ở các loài khác đã biết rồi, đúng không nhỉ?

Cám ơn BS Lương đã hiểu được ý tui và đã nói được 1 ý cực kỳ quan trọng: kô cần đọc trình tự 1 gene vẫn có thể đi dò tìm gene đó trong genome bằng Western blot.

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Western blot lấy kháng thể ở đâu? kết quả dương tính hay âm tính thì kết luận ntn?

2. Nếu ko tìm thấy ở gene ở mức độ genomics thì lại tìm ở mức độ sản phẩm của gene liệu có phải "giải pháp" k?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Các bác bình tĩnh lại một chút nào. Tôi đã đưa ví dụ của thằng Paul Nurse lên chẳng lẽ các bác không đọc một tí nào à?
Paul Nurse: tìm được gene đ/k chu kỳ ở nấm men, theo nguyên lý reduction sẽ đoán ra là có gene như vậy ở người. Thiết kết mồi PCR, probe...v.v cuối cùng vẫn không tìm thấy. Western blot nó dựa trên các vùng bảo thủ vẫn không tìm thấy (các kháng thể sử dụng cho western blot chủ yếu là dựa trên đặc hiệu trình tự chứ không phải cấu trúc, phải không nhỉ?)...nhưng mấy ông đó không dừng lại mà tiến hành một thí nghiệm rất hay là lấy cDNA của người chuyển vào nấm men, giống bị đột biến chu kỳ tế bào. Kết cục tìm ra được clone có chứa cái gene điều khiển chu kỳ ở cái clone mà sau khi được chuyển cDNA vào thì trở lại chu kỳ tế bào bình thường --> tìm ra cái gene đó ở người.

Tất nhiên kể cả khi có kết quả dương trong lai hoặc blot thì đó chỉ là thêm hy vọng cho chúng ta để làm tiếp thôi. Còn âm thì đương nhiên dễ kết luận hơn.

Dù sao với tầm cỡ các sư sĩ ở Anh mà vẫn cười vào mũi Paul Nurse khi cha này thử làm cái thí nghiệm biến nạp cDNA kia thì có lẽ ở mức độ sinh viên khi chạy RCR đủ kiểu mồi không ra thì có thể báo cáo với thầy là "vô khả thi" được rồi. Và đương nhiên là cái công trình cũng đi tong luôn. Tất nhiên khi làm TS trở lên thì "phải tìm cho ra" vì nói chung cái sách lược reductionsim (cái gì ở con vi khuẩn có thì ở con voi cũng phải có) cho đến nay vẫn đứng vững, vì vậy sẽ phải thay đổi, tìm cách tiếp cận khác.

 

[Trần Hoàng Dũng]

BS Lương có nhắc 1 ý đó là khi nc 1 gene thì ta phải biết tông ty họ hàng của nó, càng chi tiết càng tốt, đó là 1 ý cực kỳ quan trọng để tui trả lời mấy câu hỏi trên  

Tôi lấy 1 ví dụ phân tích và chứng minh, do thời gian hạn chế tui sẽ kô ghi phần Tài liệu tham khảo.

Một gene nào đó sẽ có một trong 4 khả năng sau:
a- Biểu hiện chức năng đầy đủ;
b- Tồn tại nhưng kô biểu hiện chức năng hoặc chức năng biến đổi;
c- Gene bị thay đổi cấu trúc, hướng, độ dài, ... đương nhiên là mất chức năng;
d- Mất, tức kô nằm trong genome.


Xét 1 gene A tham gia vào quá trình quang hợp, ví dụ gene rbcL và nhóm đối tượng cần quan tâm là B.

Khảo sát thông qua cơ sở dữ liệu cho thấy, họ hàng của nhóm B đã xảy ra các trường hợp sau

- Nhóm B1, mất khả năng quang hợp, dò tìm cho thấy gene rbcL bị mất.

- Nhóm B2, mất khả năng quang hợp, thực nghiệm cho thấy gene rbcL bị cắt ngằn.

- Nhóm B3, mất khả năng quang hợp, nhưng thực nghiệm cho thất gene rbcL lại còn, nhưng kô rõ chức năng.

Công việc tiến hành trên nhóm B4, nhóm quang hợp, nhưng xuất hiện vài loài riêng rẽ trong nhóm B4 kô có khả ?năng quang hợp - gọi là nhóm B5- vậy gene rbcL trong B5 chỉ có thể là b,c hoặc d.

Thiết kế nhiều primers để dò tìm gene rbcL trên nhóm B4 và B5, kết quả cho thấy kết quả dương tính với toàn bộ nhóm B4 (hiển nhiên rồi) nhưng mà với nhómn B5 thì kô. Đến đây tui xin chép lại nguyên văn những gì tui đã viết.

02- Khi tui làm PCR kô ra, có những bước sau tui sẽ hiệu chỉnh theo thứ tự ưu tiên là:

- Bỏ các hóa chất đang sử dụng, lấy cái mới như nước cất, buffer, dNTP, pha mới primers,  nếu vẫn kô ra thì thay luôn enzyme (chú ý enzyme và buffer đi kèm phải tương thích.

- Kô ra nữa thì quay lại DNA, kiểm tra độ tinh sạch bằng cách chạy điện di  kô cần có ladder, nếu DNA tinh sạch thì nó ra 1 band sáng như phage lamda, kô có vệt smear đồng thời do OD để coi DNA concentration, nếu cần thiết thì vứt DNA và tách lại, chú ý coi kỹ protocol, ở bước này kô cần chạy PCR mà chỉ cần chạy diện di và do OD để coi DNA có thật sự sạch kô, khi nào thây nó thật sạch hãy quay lại chạy PCR. Cần chú ý là các thông số hóa chất nên xem xét kỹ lưỡng và giữ hằng định thậm chí của primer cũng kô đổi, bạn chỉ nên điều chỉnh DNA concentration thôi.

- Đến đây mà nó vẫn lì lợm kô ra thì bắt đầu hiệu chỉnh PCR programe.Lưu ý rằng PCR programe thường được set up ngay từ đầu dựa trên nhiệt độ Tm của primer mà ta có được. Nếu bạn có máy PCR mà chạy được gradient nhiệt độ là quá tốt, mỗi khoảng cách nửa độ là ok.

- Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer.

- Nếu vẫn kô ra thì có hai hướng giải quyết:

a- báo cáo là gene cần tìm kô có trong genome hoặc nó bị cắt ngắn nên kô chạy PCR được.
b- Dng Westernblot để dò tìm protein của nó để xác lập rằng gene này có tồn tại trong gene hay không, sau đó tách mRNA của nó và chạy PRC ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Đến đây tại sao tui dám kết luận (a) vì gia phả lý lịch tông ty họ hàng nó cho phép tui nói điều đó, xem B1 và B2 ở trên. Lưu ý tui dùng chữ hoặc.

Tui có thể dừng lại đây và bỏ ngỏ kết luận để ai thích thì nhào vô làm tiếp.

Khi đó họ sẽ đi tiếp điều (b).

- kết quả âm tính, gene kô tạo protein ===) mất gene hoặc gene bị cắt ngắn ===) đọc 1 đoạn genome mà gene rbcL nằm giữa nhằm xác lập điều cần kết kuận.

- kết quả dương tính thì tách mRNA của nó và chạy PCR ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.



Còn làm sao sản xuất được kháng thể đơn dòng để nhận diện ư? Xem cái trang này để thử tìm câu trả lời.


http://www.agrisera.se/products/RbcLglobal.shtml
http://www.agrisera.com/shop/login.php?sess=cbcf69f29f08cee9f57063908408957a&caller=detail&art_id=81

 

[Cao Xuân Hiếu]

- Nếu vẫn kô ra thì có hai hướng giải quyết:

a- báo cáo là gene cần tìm kô có trong genome hoặc nó bị cắt ngắn nên kô chạy PCR được.
b- Dng Westernblot để dò tìm protein của nó để xác lập rằng gene này có tồn tại trong gene hay không, sau đó tách mRNA của nó và chạy PRC ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Đến đây tại sao tui dám kết luận (a) vì gia phả lý lịch tông ty họ hàng nó cho phép tui nói điều đó, xem B1 và B2 ở trên. Lưu ý tui dùng chữ hoặc.

Tui có thể dừng lại đây và bỏ ngỏ kết luận để ai thích thì nhào vô làm tiếp.

Khi đó họ sẽ đi tiếp điều (b).

- kết quả âm tính, gene kô tạo protein ===) mất gene hoặc gene bị cắt ngắn ===) đọc 1 đoạn genome mà gene rbcL nằm giữa nhằm xác lập điều cần kết kuận.

- kết quả dương tính thì tách mRNA của nó và chạy PCR ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Tôi ko nhận xét gì về các lô thí nghiệm của anh phía trước mà chỉ trọng tâm vào ý mà tôi muốn giải quyết.

Tôi xin tô đậm lại 2 hướng đi tiếp điều (b) là đọc 1 đoạn genome và chạy PCR ngược. Anh có thấy rằng vấn đề ở đây là chúng ta đang ko giải được bài toán là nhân được đoạn gene quan tâm từ DNA genome bằng PCR. Và khi đó chúng ta được gợi ý đi một con đường vòng qua Western blot và tách mRNA (mất quãng độ 1 - vài tháng, tìm được giai đoạn phát triển/mô biểu hiện gene) rồi lại quay trở lại với kỹ thuật PCR từ mRNA (RT-PCR) hoặc PCR từ genome library vậy liệu có dễ dàng hơn so với việc PCR từ genome hay không?

Còn làm sao sản xuất được kháng thể đơn dòng để nhận diện ư? Xem cái trang này để thử tìm câu trả lời.


http://www.agrisera.se/products/RbcLglobal.shtml
http://www.agrisera.com/shop/login.php?sess=cbcf69f29f08cee9f570639084 08957a&caller=detail&art_id=81

Tôi không hỏi protocol mà tôi hỏi anh định lấy cái gì để tiêm vào thỏ? Và như thí nghiệm Paul Nurse của anh Lương giới thiệu, khi có kết quả dương tính / âm tính thì sẽ kết luận như thế nào?

Anh thử tưởng tượng khi anh có problem với PCR mà anh họp working group lại mà ai đó đưa suggestion này thì anh phản ứng thế nào?

 

[Nguyễn Văn Dân]

Tôi đồng ý với Hiếu là giải quyết một vấn đề phức tạp không thể chọn phương pháp phức tạp hơn. Vấn đề bạn Lương và bạn Dũng đề cập thì khi có kết quả dương tính / âm tính cũng sẽ rất khó để kết luận như thế nào.
Theo tôi trong trường hợp này tốt nhất là kiểm tra lại các điều kiện mẫu, hóa chấ, mồi... như trên đã đề cập. Nếu mà không được nữa thì giải tán ?Bản thân khi chạy PCR đã có quá nhiều biến cố ảnh hưởng đến kết quả rồi.
Với điều kiện ở nhà mình mà chọn phương pháp thực hiện phức tạp , tốn kém (thời gian, tiền bạc, hóa chất,công sức...) chắc là đề tài tèo luôn.