What's new

Kỹ thuật điện di- thực nghiệm

Joined
Jul 30, 2004
Messages
2,169
#1
Tôi thấy diễn đàn trong thời gian vừa qua đã bàn đến rất nhiều vấn đề lý thuyết. Theo tôi nên chăng chúng ta sẽ đi vào các vấn đề thực nghiệm. Qua đó rút ra phương pháp làm thí nghiệm tối ưu trong từng điều kiện.

Bắt đầu từ những kỹ thuật đơn giản nhất.

Theo bạn, trong kỹ thuật điện di DNA dùng gel agarose nên

1. Nên đổ gel ở bao nhiêu độ C?

2. Dùng một lượng DNA là bao nhiêu (thể tích, nồng độ) đối với sản phẩm PCR, với Plasmid, với DNA genome?

3. Nạp mẫu vào giếng khi chưa đặt gel vào dung dịch đệm hay khi đã đặt gel vào bể điện di?

4. Marker (ladder) nên đặt ở giếng đầu tiên, giếng cuối cùng, giếng giữa hay cả đầu và cuối?

5. Điện di ở bao nhiêu Vôn, bao nhiêu Ampe ứng với từng loại DNA?

6. Nên pha ethidium bromide vào dung dịch đệm hay điện di xong rồi nhuộm?
 


Joined
Nov 8, 2004
Messages
1,552
#3
có nhiều trường hợp, do đối tượng nghiên cứu đặc biệt, cũng như mục đích nghiên cứu khác nhau mà tự mình phải "chế biến" lại protocol. Và khi đấy cũng cần phải biết cái gì là giới hạn cho phép của các biến đổi.

Casper cứ tiếp tục đê.

1. Gel đổi ở 60oC. Đấy là kinh nghiệm của mọi ng ở đây. Họ giữ agarose đã pha với EtBr tại các tủ ấm 60oC. Khi nào cần đổ gel thì lôi ra dùng luôn. Khỏi mất công đun nóng, để nguội. Chỉ lưu ý là khá tốn điện :) nếu công suất làm việc ko cao.
 
Joined
Jul 30, 2004
Messages
2,169
#4
1. Gel đổi ở 60oC. Đấy là kinh nghiệm của mọi ng ở đây. Họ giữ agarose đã pha với EtBr tại các tủ ấm 60oC. Khi nào cần đổ gel thì lôi ra dùng luôn. Khỏi mất công đun nóng, để nguội. Chỉ lưu ý là khá tốn điện nếu công suất làm việc ko cao.
Đây là một kinh nghiệm hay, nhưng có một vấn đề là nếu để lâu thì phải chống bay hơi. Với lại gel pha sẵn với EtBr nên lúc đổ phải cẩn thận chút, chạy xong phải vệ sinh thiết bị cẩn thận chút. Tôi thấy ở điều kiện VN nên nhuộm EtBr sau khi điện di xong thì hơn.

Theo cách ở chỗ anh Vietbio tôi thấy ở các phòng thí nghiệm VN nên chăng làm hẳn một cái phòng lạnh nhỏ 4oC, cho các thiết bị ly tâm, để một số hoá chất, mẫu vào đó. Tuy hơi tốn điện và phải mất công đầu tư thêm cái phòng lạnh nhưng lại tiết kiệm được không phải mua tủ lạnh và máy ly tâm lạnh (máy thường để ở 4oC thì có khác gì :mrgreen: ).

2.
tôi làm theo prôtcol phù hợp công việc đang tiến hành.
3. Trước đây tôi thường nạp mẫu khi đã đặt gel vào bể điện di nhưng bây giờ thì toàn nạp khô thôi (đổ gel, chờ khô, nạp mẫu rồi đặt vào bể điện di).
 
Joined
Jul 18, 2004
Messages
1,449
#5
1. Gel đổi ở 60oC. Đấy là kinh nghiệm của mọi ng ở đây. Họ giữ agarose đã pha với EtBr tại các tủ ấm 60oC. Khi nào cần đổ gel thì lôi ra dùng luôn. Khỏi mất công đun nóng, để nguội.
Cái này cũng là một điều hay vì giữ liên tục ở 60 độ C sẽ làm cho chất lượng gel ổn định hơn. Cách làm hiện nay của Phòng thí nghiệm chỗ tôi làm là mỗi lần đổ gel phải đun bằng lò vi sóng không tốt vì bản gel đổ lúc đầu (mới pha xong) và lúc cuối (gần hết lọ) thường không được như những bản đổ lúc giữa. Lúc mới pha xong mặc dù đun tới 3 - 4 phút vẫn chưa đều (kinh nghiệm bản thân) và lúc cuối thường là quá đặc (kinh nghiệm nhiều người).

2. Dùng một lượng DNA là bao nhiêu (thể tích, nồng độ) đối với sản phẩm PCR, với Plasmid, với DNA genome?
Cái này thì thực sự phụ thuộc thí nghiệm.

3. Nạp mẫu vào giếng khi chưa đặt gel vào dung dịch đệm hay khi đã đặt gel vào bể điện di?
Cái này cũng là 1 cách hay casper nhể :D . Tớ cũng thử rồi. Với mẫu bình thường check chiếc thì không quan trọng lắm, nhưng lúc thôi gel có khi rất hữu ích. Có lần tớ thôi gel, tra mẫu vào xong nó phọt hết lên vì lượng loading buffer không đủ để kéo lượng DNA lớn (30 microlitre) xuống. Có lần giếng thủng :mrgreen: toi luôn. Nếu tra mẫu ở ngoài có thể lấy lại được mẫu và nói chung dễ xử lý hơn nếu có sự cố.

5. Điện di ở bao nhiêu Vôn, bao nhiêu Ampe ứng với từng loại DNA?
Tớ luôn đặt cố định 100v (lúc nào vội thì đặt 110), tăng mA lên tối đa (300mA). Làm nhưng cũng chẳng hỏi tại sao lại là 100v.
 
Joined
Jul 30, 2004
Messages
2,169
#6
Cách làm hiện nay của Phòng thí nghiệm chỗ tôi làm là mỗi lần đổ gel phải đun bằng lò vi sóng không tốt vì bản gel đổ lúc đầu (mới pha xong) và lúc cuối (gần hết lọ) thường không được như những bản đổ lúc giữa. Lúc mới pha xong mặc dù đun tới 3 - 4 phút vẫn chưa đều (kinh nghiệm bản thân) và lúc cuối thường là quá đặc (kinh nghiệm nhiều người).
Đúng rồi, có một cách đun mà vẫn tránh được tình trạng này đó là trước khi đun bạn đem cân cái lọ lên, đun xong đem cân lại và bổ sung nước cất cho đến trọng lượng ban đầu. Như vậy sau mỗi lần đun gel sẽ không bị đặc lại. Nhược điểm là mất thời gian quá, nên tớ cũng chả chịu làm :mrgreen: .

Cái này cũng là 1 cách hay casper nhể . Tớ cũng thử rồi. Với mẫu bình thường check chiếc thì không quan trọng lắm, nhưng lúc thôi gel có khi rất hữu ích. Có lần tớ thôi gel, tra mẫu vào xong nó phọt hết lên vì lượng loading buffer không đủ để kéo lượng DNA lớn (30 microlitre) xuống. Có lần giếng thủng toi luôn. Nếu tra mẫu ở ngoài có thể lấy lại được mẫu và nói chung dễ xử lý hơn nếu có sự cố.
Cái này là thấy ông ở Pháp về làm thế, bắt chước cũng thấy hay. Có vấn đề là lúc đặt gel vào bể điện di phải cẩn thận không có mẫu trào hết ra ngoài.

Một nhược điểm của việc nạp mẫu khi đặt gel trong bể điện di (có dung dịch đệm) là trong giếng điện di đã có sẵn dung dịch đệm nên khi ta nạp mẫu, mẫu sẽ bị pha loãng ra hơn nhiều so với phương pháp kia. Chưa kể mẫu của ta phải chiến đấu với bọn đệm có từ trước trong giếng để đuổi chúng ra.
 
Joined
Nov 8, 2004
Messages
1,552
#7
casper said:
Cái này cũng là 1 cách hay casper nhể . Tớ cũng thử rồi. Với mẫu bình thường check chiếc thì không quan trọng lắm, nhưng lúc thôi gel có khi rất hữu ích. Có lần tớ thôi gel, tra mẫu vào xong nó phọt hết lên vì lượng loading buffer không đủ để kéo lượng DNA lớn (30 microlitre) xuống. Có lần giếng thủng toi luôn. Nếu tra mẫu ở ngoài có thể lấy lại được mẫu và nói chung dễ xử lý hơn nếu có sự cố.
Cái này là thấy ông ở Pháp về làm thế, bắt chước cũng thấy hay. Có vấn đề là lúc đặt gel vào bể điện di phải cẩn thận không có mẫu trào hết ra ngoài.

Một nhược điểm của việc nạp mẫu khi đặt gel trong bể điện di (có dung dịch đệm) là trong giếng điện di đã có sẵn dung dịch đệm nên khi ta nạp mẫu, mẫu sẽ bị pha loãng ra hơn nhiều so với phương pháp kia. Chưa kể mẫu của ta phải chiến đấu với bọn đệm có từ trước trong giếng để đuổi chúng ra.
Tôi thấy có vẻ kinh nghiệm này chỉ là cảm tính. Việc bạn load mẫu vào giếng thì chuyện hòa loãng mẫu là tất yếu. Khi đấy cái quan trọng là bạn có bao nhiêu ng DNA ở mỗi giếng chứ đâu phải là nồng độ :evil:

Bạn load mẫu vào khi để bản gel ở ngoài thì chẳng qua cũng như 1 bước cô đặc mẫu (giảm thể tích) vì loading buffer của bạn sẽ phải thấm vào giếng và làm ẩm gel agarose thôi. Bạn đặt gel đã load mẫu vào dung dịch đệm mà để ộc hết mẫu ra khỏi giếng thì chẳng còn giá trị gì.

Khi load mẫu vào giếng đặt trong bể điện di thì DNA do đã hình thành liên kết yếu với bromphenol blue nên lắng nhanh xuống đáy giếng, chẳng ai phải đánh đuổi ai cả.

Cái quan trọng là lượng DNA tối đa có thể đưa mẫu vào 1mm giếng là bao nhiêu? Đã có ai điện di để thôi gel mà bản điện di không chạy trong khi bọt khí sôi sùng sục chưa?
 
Joined
Jul 30, 2004
Messages
2,169
#8
Tôi thấy có vẻ kinh nghiệm này chỉ là cảm tính
Có thể, quan trọng là khi làm thì thấy tiện lợi hơn nhiều. Nhất là có thể nhìn rõ giếng. Hơn nữa nếu khi điện di rất nhiều giếng, có thể dùng pipet nhiều đầu để tra mẫu một cách dễ dàng hơn khi đã đặt trong đệm.

Bạn đặt gel đã load mẫu vào dung dịch đệm mà để ộc hết mẫu ra khỏi giếng thì chẳng còn giá trị gì
Thế nên đã có chú ý là cẩn thận. Quan trọng là theo cách làm này thì nhiều cái lợi hơn cái hại.
 
Joined
Nov 19, 2004
Messages
6
#9
Tôi đổ khoảng vài bản gel cùng một lần, ngâm trong TBE 0.5 hoặc 1X (tủ lạnh 4 độ), dùng vô tư trong vòng 1 đến 2 tháng, ko thấy ảnh hương gì cả.
Lưu ý lượng DNA chạy, nếu nhiều quá thì đổ gel đầy lên, ko có gì qua phức tạp.
 
Joined
Jan 7, 2005
Messages
88
#10
Khi load mẫu vào giếng đặt trong bể điện di thì DNA do đã hình thành liên kết yếu với bromphenol blue nên lắng nhanh xuống đáy giếng, chẳng ai phải đánh đuổi ai cả.
Bây giờ mới biết là Bromophenol blue (biết đâu lại cả cylenxyanol) có cái chức năng kéo mẫu xuống . vẹtBio ơi, cái này hay à nha !!!!! chuyện lạ à nha !!!!!! phét minh mới à nha !!!!!!!!


Từ thuở biết cầm pippet tới giờ chỉ biết có succrose, glycerol .. có cái chức năng ấy thôi !!!


Mình phải xem lại kiến thức của mình mới được !!!!!!!!!
 
Joined
Nov 8, 2004
Messages
1,552
#11
sv_ngheo said:
Khi load mẫu vào giếng đặt trong bể điện di thì DNA do đã hình thành liên kết yếu với bromphenol blue nên lắng nhanh xuống đáy giếng, chẳng ai phải đánh đuổi ai cả.
Bây giờ mới biết là Bromophenol blue (biết đâu lại cả cylenxyanol) có cái chức năng kéo mẫu xuống . vẹtBio ơi, cái này hay à nha !!!!! chuyện lạ à nha !!!!!! phét minh mới à nha !!!!!!!!

Từ thuở biết cầm pippet tới giờ chỉ biết có succrose, glycerol .. có cái chức năng ấy thôi !!!


Mình phải xem lại kiến thức của mình mới được !!!!!!!!!
okie im wrong. nó chỉ có chức năng color marker và pH indicator thôi.
 
Joined
Jan 7, 2005
Messages
88
#12
Chời..ơi, tưởng đâu kiến thức mình còn hổng, hóa ra người ta nhầm !


Tôi sẽ nêu ra đây một số mẹo rất hay trong quá trình thực nghiệm làm điện di, mong rằng mọi người cùng rút kinh nghiệm:

- Cẩn thận pha nhầm, thay vì buffer lại đổ dI H2O vào

- Để tránh bọt khi đổ gel agar, rất đơn giản, đổ buffer vào, ngồi suy nghĩ khoảng 10 phút mình đã ăn món gì tối hôm qua. OK, cho vào lò visóng, đun OK đi, bọt rất ít, vì tinh bột bị no quá rồi....

- Đừng rút comb trước 30 phút, để đáy well ổn định hơn... Nên dùng một số dung dịch (loại chống bám dính) lau kỹ răng, sẽ OK hơn.

- Nếu rỗi rãi, đổ buffer ra cái chén, thử trước xem tối thiểu mất bao nhiêu dye thì kéo được mẫu xuống đáy well. Nên cho tối thiểu dye để kết quả là đẹp nhất khi chụp ảnh. Nếu dùng commecial dye thì chỉ cần 0.5X là đủ.

- Ảnh sẽ rất đẹp nếu đổ gel nồng độ thấp (<1%) và mỏng (<0.5cm).

- Nếu cần thôi gel mà wells quá nhỏ, lấy băng keo trong, dán dăm răng lại, tha hồ load mẫu, nhiêu cũng được. Nên chia bản gel thành 2 phần, một nhuộm lấy tương quan để cắt trích nửa còn lại.

- Đề phòng trường hợp SSCP (đa hình hình dạng sợi), nên dùng dye có formamide (chỉ có ích nhiều khi chạy PAGE).

- Đổ sẵn dăm bản, hoặc đổ một bản to rồi tùy thuộc số mẫu cần kiểm tra mà cắt ra số wells cần thiết...

- Trước khi dùng nên rửa sạch đáy wells, đề phòng "rác" hoặc agar dư..


Đó mới chỉ là một số ít kinh nghiệm chạy gel agar thôi, còn chạy PAGE tôi có cả tỉ kinh nghiệm, toàn là xương máu, đủ dùng....

Sẽ chia sẻ nếu có người cần !
 
Joined
Jul 30, 2004
Messages
2,169
#13
Đừng rút comb trước 30 phút, để đáy well ổn định hơn... Nên dùng một số dung dịch (loại chống bám dính) lau kỹ răng, sẽ OK hơn.
Nên dùng chất gì làm chất chống bám dính?

Đề phòng trường hợp SSCP (đa hình hình dạng sợi), nên dùng dye có formamide (chỉ có ích nhiều khi chạy PAGE).
Bạn có thể nói rõ hơn không?

Khi chỉ cần xác định xem PCR có ra sản phẩm không thì khi cần 16 giếng chẳng hạn, chỉ cần đổ 8 giếng rồi cắm thêm một cái lựợc ở giữa, khoảng chạy bị ngắn đi nhưng chả sao, lại tiết kiệm được nhiều thứ.


Đó mới chỉ là một số ít kinh nghiệm chạy gel agar thôi, còn chạy PAGE tôi có cả tỉ kinh nghiệm, toàn là xương máu, đủ dùng....

Sẽ chia sẻ nếu có người cần !
Có tôi cần nè. Rất mong mọi người cùng đóng góp, chia xẻ kinh nghiệm.

Có một cách chụp ảnh trong trường hợp điện di protein rất nét đó là bọc cái gel (sau khi điện di xong) vào nilon trong, sau đó cho vào mày.... scan :mrgreen: .
 
Joined
Jan 7, 2005
Messages
88
#14
casper said:
Nên dùng chất gì làm chất chống bám dính?!

Một số chất có thể chống bám dính như Sigma code (Sigma), Repel Silane (PlusOne) hoặc BlueSlick (Serva)... Yên tâm là đều vô hại cho quá trình điện di vì đều là những chất chuyên dụng.. (có thể check qua google)




Đề phòng trường hợp SSCP (đa hình hình dạng sợi), nên dùng dye có formamide (chỉ có ích nhiều khi chạy PAGE).

Bạn có thể nói rõ hơn không?

Bạn xem lại khái niệm SSCP, khi có mặt formamide - tác nhân gây biến tính - thì DNA duỗi ra sạch, làm gì còn conformation polymophism...



Có tôi cần nè. Rất mong mọi người cùng đóng góp, chia xẻ kinh nghiệm.

Nói chung là phải thông qua trao đổi, chứ tôi cứ độc thoại một mình rất dở. Bạn cần hỏi gì về PAGE?
 
Joined
Jul 30, 2004
Messages
2,169
#15
Nói chung là phải thông qua trao đổi, chứ tôi cứ độc thoại một mình rất dở. Bạn cần hỏi gì về PAGE?
Kinh nghiệm của bạn để có một bản gel đẹp? Ở một vài box khác tôi thấy bàn đến vấn đề khi không có SDS protein bị đóng thành cục ở đầu giếng.

http://sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Forums&file=viewtopic&t=414

http://sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Forums&file=viewtopic&t=498

bạn nghĩ sao về vấn đề này? Cách khắc phục?
 
Joined
Jan 7, 2005
Messages
88
#16
Tiếc là tôi chỉ có kinh nghiệm về PAGE đối với DNA thôi, còn với protein, xin nói thẳng là tôi không biết gì mấy

Bạn có câu hỏi nào về điện di đối với DNA không, tôi sẽ cố gắng thử trả lời
 
Joined
Jan 7, 2005
Messages
88
#18
Ở nhiệt độ 60đến 65 độ C có lẽ hơi cao, khi đó lượng hơi nước bốc lên dễ làm cho nồng độ gel thay đổi.

Một mẹo nhỏ: Cứ để cho đến khi bạn có thể chạm tay vào thành bình và cảm thấy chịu đựng đựơc trong vòng 5 giây là ổn.
 
Joined
Jul 26, 2005
Messages
17
#20
Em thấy anh/chị casper nói nhiều mẹo khá hay và khá thường gặp:

- Cẩn thận pha nhầm, thay vì buffer lại đổ dI H2O vào
Hồi xưa nhầm hoài, chạy chán chê đến lúc xem chẳng thấy DNA đâu    8)

- Để tránh bọt khi đổ gel agar, rất đơn giản, đổ buffer vào, ngồi suy nghĩ khoảng 10 phút mình đã ăn món gì tối hôm qua. OK, cho vào lò visóng, đun OK đi, bọt rất ít, vì tinh bột bị no quá rồi....
Đun gel bằng lò vi sóng chẳng vấn đề gì cả, có điều thường xuyên check và lắc đều cho đến khi completely transparent không còn tí particles nào thì là OK, đổ gel gentle để tránh bọt.
Add EtBr vào flash trước khi đổ gel là hay nhất tránh trường hợp phân tán không đều. Nhưng EtBr có radical, liệu đun nóng = lò vi sóng trong lần sử dụng sau có không safe lắm không nhỉ. Em thắc mắc thế thôi chứ người ta vẫn làm.

- Đừng rút comb trước 30 phút, để đáy well ổn định hơn... Nên dùng một số dung dịch (loại chống bám dính) lau kỹ răng, sẽ OK hơn.
Trước khi dùng thường em cũng lau comb kĩ hơn và đợi thời gian nhất định rồi mới rút comb (thường thì 2-3% gel cũng mất đến 25-30 phút để gel cứng)

- Nếu rỗi rãi, đổ buffer ra cái chén, thử trước xem tối thiểu mất bao nhiêu dye thì kéo được mẫu xuống đáy well. Nên cho tối thiểu dye để kết quả là đẹp nhất khi chụp ảnh. Nếu dùng commecial dye  thì chỉ cần 0.5X là đủ.
Cái này em chưa làm bao giờ, nhưng cũng là một mẹo hay. Có lần dye của tụi em không đủ nặng, chèn lên cả sản phẩm làm mất công phải run lại gel.

- Ảnh sẽ rất đẹp nếu đổ gel nồng độ thấp (<1%) và mỏng (<0.5cm).

- Nếu cần thôi gel mà wells quá nhỏ, lấy băng keo trong, dán dăm răng lại, tha hồ load mẫu, nhiêu cũng được. Nên chia bản gel thành 2 phần, một nhuộm lấy tương quan để cắt trích nửa còn lại.

- Đề phòng trường hợp SSCP (đa hình hình dạng sợi), nên dùng dye có formamide (chỉ có ích nhiều khi chạy PAGE).

- Đổ sẵn dăm bản, hoặc đổ một bản to rồi tùy thuộc số mẫu cần kiểm tra mà cắt ra số wells cần thiết...

- Trước khi dùng nên rửa sạch đáy wells, đề phòng "rác" hoặc agar dư..
Những cái này thì tùy hoàn cảnh :oops:, em sắp thử  :roll: .

Ngoài ra em nghĩ với gel có nồng độ cao thì nên đổ lúc còn ấm "nhiều" (chứ không ấm "ít" như gel nđộ thấp) vì rất fast solidify.

Thêm nữa, thi thoảng em còn lười làm gel sẵn rồi sử dụng hai lần. Gel cắm 2 comb, chạy comb dưới trước, đến ngày hôm sau chạy tiếp lên trên. Kết quả vẫn ngon lành, không vấn đề gì.
 
Top