linhmoi2005
Junior Member
Chào các a chị,e đang tìm tài liệu về thiết kế probe để phát hiên đột biến.
a chi có kinh nghiệm chỉ e với. về các thông số của probe. e cám ơn
a chi có kinh nghiệm chỉ e với. về các thông số của probe. e cám ơn
hiết kế probe
- Thread starter linhmoi2005
- Start date
Mình dungf phần mềm primer express 3.0 de thiet kế probe dung cho phat hien SNP o chuot. Sau do chạy RT-PCR de so sanh Tm curve. Gui kem ban luon cach thiet ke probe cho SNP trong primer express 3.0 manual
create a new allelic discrimination document:
1. Select File > New to open the New dialog box.
2. In the Type list, select TaqMan® MGB Allelic Discrimination or TaqMan®
Allelic Discrimination. For best results, use TaqMan MGB probes. MGB probes
are shorter than conventional probes and are more specific to the target sequence.
3. Click OK.
Loading a DNA
Sequence File
A sample sequence file, AY228765.txt, is located in the sample sequences folder within
the Primer Express folder. You can use this sample file to experiment with the software
and design your primers and probes. Note that one forward primer, one reverse primer,
and two probes are designed. The two probes, one for each of the SNP sites, will not be
identical. However, the two probes must be designed using the same strand (sense
strand).
To load a sequence file:
1. Select Tools > Add DNA File ( ). Note you can also copy and paste or type
your sequence file in the Sequence tab.
2. At the Add DNA File dialog box, navigate to and select the desired file. For
information on the various file formats supported, see Primer Express Software
Version 3.0 Online Help.
3. Click Add. Primer Express software loads the nucleotide sequence from the file and
displays the sense strand in the Sequence tab (see “Figure 9. Sequence tab” on
page 30). The sequence serves as the starting point for primer and probe design.
To assign a SNP target:
1. Highlight the SNP target site.
2. Select Edit > Annotate > SNP Target ( ) then select the variant for the SNP
site. To determine the variant to select, find the two possible variant bases for your
SNP, then click the code between the two bases. In the example sequence provided,
the SNP target is located at position 528 as a G/A variant, so click R, then OK (see
“Figure 10. Determining variant using SNP Target Tool” on page 31).
To find primers and probes:
Select Tools > Find Primers/Probes ( ). Primer Express software performs its
calculations based on default parameter values.
The status bar, located at the bottom of the window, displays information about the
progress of the calculations as the software searches for primer, probe, and amplicon
sets. If primers and probes are found, go to “Viewing Results”.
If primers and probes were not found:
If the software does not find primers and probes using default parameters, a pop-up will
appear stating that no acceptable primer pairs were found and that you can see the
Interim Results window. For more information on Interim Results, see Primer Express
Software Version 3.0 Online Help.
Viewing Results Primer Express software automatically displays the Primers/Probes tabs if it finds
primers and probes (see “Figure 11. Primer/Probe Tab displaying candidate primers and
probes” on page 32). The Primers/Probes tab displays the candidate Primers & Probes
table that contains information about forward primers, reverse primers, probes, and
amplicons. The forward primer sequences are displayed using the left-to-right 5′-to-3′
convention, and reverse primer sequences are displayed using the right-to-left 5′-to-3′
convention.
Evaluating the candidate primer and probe sets:
The Location section illustrates the location of the primers and probes within the line
sequence. The number above the line is the starting base; the number below the line is
the ending base. Note that you can also see the corresponding location of a selected
candidate Primer/Probe set in the Sequence tab.
In the sequence tab, the probe 1 will be highlighted in pink, probe 2 will be highlighted
in green (if probe 1 and 2 overlap, the overlap region will appear green), the forward
primer in blue, and the reverse primer in yellow (see “Figure 12. Probe annotations in
Sequence tab” on page 33). These default color designations can be changed by clicking
Tools > Options. If you place your cursor over any of these annotations, a tool tip will
appear showing the name of the annotation (Probe, Forward Primer, Reverse Primers)
start and end locations, Tm and GC%.
As a general guideline, select the primer/probe sets with a low Penalty score and a low
amplicon length (if the Penalty score and Amplicon Length fields are not displayed,
scroll to the right in the table). However, all primer/probe sets generated using default
parameters meet primer and probe guidelines. For more information regarding Penalty
scores, see Primer Express Software Version 3.0 Online Help.
Saving the
Document
Before proceeding to other designs, be sure to save the Primer/Probe ann
create a new allelic discrimination document:
1. Select File > New to open the New dialog box.
2. In the Type list, select TaqMan® MGB Allelic Discrimination or TaqMan®
Allelic Discrimination. For best results, use TaqMan MGB probes. MGB probes
are shorter than conventional probes and are more specific to the target sequence.
3. Click OK.
Loading a DNA
Sequence File
A sample sequence file, AY228765.txt, is located in the sample sequences folder within
the Primer Express folder. You can use this sample file to experiment with the software
and design your primers and probes. Note that one forward primer, one reverse primer,
and two probes are designed. The two probes, one for each of the SNP sites, will not be
identical. However, the two probes must be designed using the same strand (sense
strand).
To load a sequence file:
1. Select Tools > Add DNA File ( ). Note you can also copy and paste or type
your sequence file in the Sequence tab.
2. At the Add DNA File dialog box, navigate to and select the desired file. For
information on the various file formats supported, see Primer Express Software
Version 3.0 Online Help.
3. Click Add. Primer Express software loads the nucleotide sequence from the file and
displays the sense strand in the Sequence tab (see “Figure 9. Sequence tab” on
page 30). The sequence serves as the starting point for primer and probe design.
To assign a SNP target:
1. Highlight the SNP target site.
2. Select Edit > Annotate > SNP Target ( ) then select the variant for the SNP
site. To determine the variant to select, find the two possible variant bases for your
SNP, then click the code between the two bases. In the example sequence provided,
the SNP target is located at position 528 as a G/A variant, so click R, then OK (see
“Figure 10. Determining variant using SNP Target Tool” on page 31).
To find primers and probes:
Select Tools > Find Primers/Probes ( ). Primer Express software performs its
calculations based on default parameter values.
The status bar, located at the bottom of the window, displays information about the
progress of the calculations as the software searches for primer, probe, and amplicon
sets. If primers and probes are found, go to “Viewing Results”.
If primers and probes were not found:
If the software does not find primers and probes using default parameters, a pop-up will
appear stating that no acceptable primer pairs were found and that you can see the
Interim Results window. For more information on Interim Results, see Primer Express
Software Version 3.0 Online Help.
Viewing Results Primer Express software automatically displays the Primers/Probes tabs if it finds
primers and probes (see “Figure 11. Primer/Probe Tab displaying candidate primers and
probes” on page 32). The Primers/Probes tab displays the candidate Primers & Probes
table that contains information about forward primers, reverse primers, probes, and
amplicons. The forward primer sequences are displayed using the left-to-right 5′-to-3′
convention, and reverse primer sequences are displayed using the right-to-left 5′-to-3′
convention.
Evaluating the candidate primer and probe sets:
The Location section illustrates the location of the primers and probes within the line
sequence. The number above the line is the starting base; the number below the line is
the ending base. Note that you can also see the corresponding location of a selected
candidate Primer/Probe set in the Sequence tab.
In the sequence tab, the probe 1 will be highlighted in pink, probe 2 will be highlighted
in green (if probe 1 and 2 overlap, the overlap region will appear green), the forward
primer in blue, and the reverse primer in yellow (see “Figure 12. Probe annotations in
Sequence tab” on page 33). These default color designations can be changed by clicking
Tools > Options. If you place your cursor over any of these annotations, a tool tip will
appear showing the name of the annotation (Probe, Forward Primer, Reverse Primers)
start and end locations, Tm and GC%.
As a general guideline, select the primer/probe sets with a low Penalty score and a low
amplicon length (if the Penalty score and Amplicon Length fields are not displayed,
scroll to the right in the table). However, all primer/probe sets generated using default
parameters meet primer and probe guidelines. For more information regarding Penalty
scores, see Primer Express Software Version 3.0 Online Help.
Saving the
Document
Before proceeding to other designs, be sure to save the Primer/Probe ann
primer express 3.0
bạn có thể tham khảo ở tài liệu này. nó co hướng dẫn cho cách đặt probe cho SNP. Nếu cần mình có thể giúp bạn đặt probe
Chào Cherry. Cho mình hỏi trường hợp này: mình cần phân biệt số lượng 2 gene trong genome người. Hai gene này có độ tương đồng rất cao và thường hay trao đổi đoạn cho nhau. Mình sẽ dùng probe đặc hiệu cho trình tự mỗi gene ở một đoạn nhất đinh.
Thứ nhất là: probe này nên thiết kế thế nào. Bài báo của tác giả Mỹ dùng probe mà 2 gene này khác nhau tại 1 vị trí. Thế khác nhau 2, 3 hay nhiều vị trí hơn có được không?
Thứ hai là dùng template gì cho standard. Mình có full sequence của cả gene và cả từng exon (probe gắn vào exon) đã gắn vào plasmid.
Cám ơn trước.
Thứ nhất là: probe này nên thiết kế thế nào. Bài báo của tác giả Mỹ dùng probe mà 2 gene này khác nhau tại 1 vị trí. Thế khác nhau 2, 3 hay nhiều vị trí hơn có được không?
Thứ hai là dùng template gì cho standard. Mình có full sequence của cả gene và cả từng exon (probe gắn vào exon) đã gắn vào plasmid.
Cám ơn trước.
probe sau do dung phuong phap gi de dam so luong copies trong genome?
làm theo tác giả thì chắc là Ct
Hi. Xin lối không trả lới sớm vì chỗ mình lệch Viet nam 13 tiếng.
Bên mình có bộ phận DNA core facilities, chuyên thiết kế probe và đặt primer ( có phòng tổng hợp primer, nên trong tháng năm này bạn nào ở Saigon cần có primer mình sẽ gửi tặng vì bạn mình sẽ về thăm vietnam trong thời gian từ 19/5 đến 10/6). Đó là tại sao mình nói có thể thiết kế hộ Probe cho viêc tìm SNP.
Câu hỏi của bạn là để thử trình độ đây. Mình dùng cả RT- PCR so sánh MC của mẫu WT và mẫu có SNP và cũng dùng DNA sequence để kiểm tra trình tự của hai mẫu trên. Phòng mình chi dùng RT- PCR so sánh MC cho một điểm đột biến- SNP. Trong trường hợp có 2 đến 3 điểm đột biến- SNPs, như bạn hỏi, bọn mình dùng DNA sequence để kiểm tra ( tuy nhiên ít khi bên mình gây đột biến nhiều điểm cùng lúc trên một full gen mà thường thay từng điểm một, bởi bạn sẽ rất khó so sánh gen có nhiều đột biến với WT, ví dụ chức năng, hoạt tính...).
Mình dùng Quicchange site directed Mutagenesis kit và express protein đột biến mong muốn ở COS7 cells hoặc Sf-9 cells. Mình chưa làm phân biệt số lượng 2 gene trong genome người và hai gene này có độ tương đồng rất cao và thường hay trao đổi đoạn cho nhau nên khó trả lời
Ho Huu Tho
Senior Member
Minh nghi la khac nhau 2,3 hay nhieu vi tri thi cang tot chu nhi, mien la trinh tu bo sung voi probe khong bi thay doi la duoc. The ban da thiet ke cai nay the nao?
Standard càng giống với target càng tốt, nhưng trong trường hợp này thì mình thấy là full sequence của cả gene hay từng exon đều được, chắc không ảnh hưởng nhiều đến kết quả.
Ho Huu Tho
Senior Member
Bạn nắm được nguyên lý chọn probe dùng cho phát hiện SNP của phần mềm này thì chia sẻ một chút được không. Phần mềm này chắc là mất tiền rồi, không biết có đắt không nhỉ?
