Digestion BamHI/sphI ?

[Hoàng Anh Hoàng]

Chào cả nhà,

Mình đang clone đoạn dài 3140bp vào plasmid vector pHSG299 (2673 bp), sử dụng 2 enzyme giới hạn BamHI và sphI.

+ đoạn 3140bp đc amplify bằng PCR với cặp mồi gắn trình tự cắt của BamHI và sphI. PCR xong, dùng BamHI (Invitrogen) cắt trước (37oC, overnight). Sau đó tinh sạch bằng Kit của Promega. Điện di kiểm tra nồng độ, rồi cắt tiếp bằng enzyme sphI (Takara) (37oC, overnight). Sau đó gel tinh sạch, điện di kiểm tra nồng độ.
+ plasmid vector cũng làm hoàn toàn tương tự như trên.
+ Sau đó ligation với tỉ lệ đoạn chèn: vector = 1:1 - 3:1 (16oC, overnight)
+ Sau đó mình thử cả xốc nhiệt (dùng Top10 competent cells của Invitrogen) và electroporation (có tinh sạch dùng ethanol).
+ Kiểm tra khuẩn lạc trên LB agar có kháng sinh và X-gal.
Kết quả sốc nhiệt chỉ có vài khuẩn lạc trắng, hầu như ko có khuẩn lạc xanh. Kiểm tra PCR M13 khuẩn lạc trắng ra sản phẩm ko đặc hiệu (có band thì rất ngắn vài trăm bp, có band thì lên tới 6000-7000bp lận). Kết quả electroporation, nhiều khuẩn lạc hơn, tuy nhiên PCR M13 xong, thất bại tiếp (ko xuất hiện band).

Anh chị và các bạn cho mình hỏi protocol như trên có vấn đề gì ko? Sử dụng 2 enzymes khác công ty như trên có ảnh hưởng gì lớn ko tới hiệu suất cắt? Xin chân thành cảm ơn !

 

[thanhtam_2601]

Theo mình thì sử dụng 2 enzyme ở 2 hãng khác nhau không có vấn đề gì nhưng sẽ làm giảm hiệu suất thu hồi DNA vì phải qua hai bước tinh sạch và vấn đề để DNA ở ngoài nhiệt độ 37oC qua đêm những 2 ngày có thể DNA của bạn bị nhiễm các yếu tố khác từ Lab. Vậy tốt nhất thì nên sử dụng enzyme cùng 1 hãng và cắt luôn 1 lần.
Còn về vấn đề thấy xuất hiện khuẩn lạc trắng nhưng kiểm tra không có gen thì có thể do plasmid gốc chưa được cắt hoàn toàn bị lẫn khi tinh chế vì vậy có thể nồng độ plasmid sử dụng quá nhiều nên dẫn tới cắt không hoàn toàn.
Một kinh nghiệm nữa khi làm cloning là làm càng nhanh thì càng tốt để tránh DNA bị phân hủy hoặc các đầu cắt bị mất vài nu gây hiện tượng nỗi nhầm lẫn.

 

[Hoàng Anh Hoàng]

Tnx bạn đã góp ý.
Cloning này mình đã giải quyết xong rồi. Vấn đề của mình, theo mình nghĩ, nằm ở việc thiết kế primer đầu gắn SphI: mình add ít bp nên có thể cắt ko đc hoàn toàn. Mình chọn enzyme khác, cắt vào vị trí sâu bên trong chút, vậy là ok.