Điện di protein trên SDS-PAGE

[Nguyễn Ngọc Lương]

công việc này có vẻ thường nhật lắm nhưng tôi thấy để ra được một bản điện di đẹp không phải dể. Thông thường là do giếng bị hở nên các băng nó chạy lộn qua nhau rất xấu. Có bạn nào có mẹo chùi giếng cho sạch mà không làm cho thành giếng nó hở không?

 

[Nguyễn Thị Phương Trang]

Câu hỏi của drosophilla gửi cả tháng rồi mà sao không thấy ai trả lời nhỉ, hôm nay tớ mới đọc, híc nhưng cũng không hiểu lắm ý của drosophilla thành giếng bị hở là ntn. Tuy nhiên tớ nghĩ giếng chỉ bị hở (thông sang giếng khác) khi mà miếng gel ngăn cách giữa 2 giếng bị đứt, cho nên khâu này drosophilla phải cẩn thận khi rút lược để không làm gãy đoạn gel này. Nhiều lab ở nhà mình với phương châm "tiết kiệm là quốc sách" nên bộ điện di thường là tự làm lấy (chứ không phải là bộ chuẩn), đâm ra kính, lược, spacer không cùng bộ nên cũng gặp nhiều khó khăn khi muốn có 1 bản gel đẹp. Tớ cũng đã từng ở trong tình trạng này gần 3 năm trời nên cũng có 1 số kinh nghiệm thế này, mong có thể chia xẻ được cùng drosophilla.
- Vì độ dày của lược không thật khớp với độ dày của spacer (hoặc 2 tấm kính kẹp không được tốt -không khít) thì khi đổ gel hay bị có nhiều màng gel mỏng ở giếng lúc rút lược ra, do vậy khâu thông giếng trước khi load mẫu là rất quan trọng, bạn có thể dùng bơm kim tiêm loại to 1 chút (10ml, nhưng tất nhiên phải vừa với gel của bạn), để hút đệm ở trong gíếng ra, cũng là đồng thời rút hết những màng gel mỏng bám ở giếng, cũng phải thật khéo để kim tiêm không chọc thủng gel.
- Cũng do 2 tấm kính kẹp không tốt nên mẫu khi load vào có thể sẽ bị chảy ra bên thành bản gel, cho nên trứớc khi nhuộm bản gel bạn nên rửa qua bản gel bằng nước cất.
- Cuối cùng đừng load mẫu quá đầy giếng vì nếu không thì mẫu từ giếng này sẽ bị tràn sang giếng bên cạnh
- Muốn có 1 bản gel đẹp thì cũng không nên chạy điện di với cường độ quá nhanh (thông thường cứ khỏang 100mV là được), trong thời gian mẫu chạy ở phần stacking gel thì nên chỉnh nguồn cho mẫu chạy chậm hơn 1 chút (các protein được xuất phát cùng 1 điểm trên separating gel thì sẽ tạo vạch đẹp và chính xác hơn).
---------
Cũng vừa rồi tớ có đọc 1 bài nói về điện di acrylamide without SDS, (xin lỗi vì lại viết vào đây vì bây giờ chẳng nhớ nó ở box nào), có bạn nào (cũng không nhớ tên nữa) viết sai quá đi mất đâm ra tớ xin mạn phép chỉnh lại 1 tý.
Đó là khi bạn chạy điện di không có SDS thì các protein của bạn vẫn phân tách và tạo vạch trên bản gel (chứ hoàn toàn không phải là nó đóng thành cục ở đầu giếng), Kể cả khi bạn chạy trực tiếp mẫu vừa tách chiết mà không qua bất kỳ 1 khâu xử lý nào như biến tính nhiệt...thì các protein vẫn phân tách thành vạch trên bản gel của bạn.
Tác dụng chính của SDS là anion hóa, có nghĩa là nó sẽ làm cho tất cả các protein của ban tích điện âm (để giúp cho protein của bạn dễ dàng chạy được từ âm (-) sang dương (+) dưới tác dụng của điện trường, (SDS cũng là 1 thành phần trong đệm chạy điện di), ngoài ra nó cũng có thể cắt các cầu đi sun fát trong phân tử protein nhưng rất rất yếu thôi, do vậy tác dụng chính của SDS không phải là biến tính protein, khâu biến tính chính là lúc bạn đun sôi 5 phút (cùng với cả tác dụng của b-mercapto nữa).
Sự khác nhau giữa SDS và DTT cũng chính là ở chỗ này, tác dụng chính của DTT là cắt các liên kết S-S, cắt rất mạnh, nhưng không làm cho protein tích điện âm.
Điện di không có SDS người ta gọi nó là native gel, dùng để chạy điện di enzyme và các loại protein mà vẫn muốn giữ hoạt tính.
Để hiểu rõ thêm, bạn có thể dùng từ khóa là native gel để search trên google.
- Cũng nhân đây tớ xin có 1 đề nghị thế này, bởi vì sinhhocvietnam.com là 1 website chuyên ngành nên khi các bạn post bài trả lời câu hỏi nếu chưa chắc chắn thì không nên post, vì nếu không sẽ làm các bạn đọc sau hiểu sai vấn đề (trong khoa hoc điều này rất quan trọng), nhất là với những bạn không chuyên sâu hoặc mới bắt đầu nghiên cứu mà muốn tìm hiểu thêm.

 

[Nguyễn Hồng Khanh]

Agarose và cả Acrylamide dùng để điện di DNA, Acrylamide có khả năng tách các đọan DNA có kích thước nhỏ hơn.
1. Tại sao mình không thấy sử dụng Agarose để điện di Protein?
2. Điện di Protein thì sủ dụng buồng điện di dạng đứng?
3. Gel polyacrylamide sử dụng cho buồng điện di dạng đứng?
4. Gel agarose sử dụng cho buồng điện di dạng ngang?
Trả lời giúp mình với nhé!
Chân thành cảm ơn.
khanhtsc@yahoo.com

 

[Nguyễn Đình Phương]

Theo những gì mình được biết về Denaturing conditions thì
SDS có tác dụng làm dãn mạch protein thành dạng thẳng, và tích điện âm
disulphide bridges  bị bẻ gãy bằng tác dụng của 2- mercaptoethanol or dithiothreitol, chứ không phải SDS
Tốc độ di chuyển của protein phụ thưộc intrinsic electrical charge of the polypeptide, chứ không phải là molecular weight
Theo kinh nghiệm làm việc với discontinuous buffer systems, có lẽ cũng tương tự trong trường hợp continuous, thì để thu được bản gel đẹp các bạn nên chú ý một số điểm:
Nếu đổ gel không đều hoặc nồng độ protein lớn sẽ làm cho gel bj smearing, protein di chuyển lệch hướng và trộn lẫn vào nhau.
Dùng chung một buffer system, hoặc buffer concentration giữa các sample không quá chênh lệch, phải dialysis
trước khi load

Khi chạy điện di, cường độ dòng điện đựoc giữ cố định, chứ không phảo là hiệu điện thế, do vậy tùy trường hợp
bạn có thể giữ khoảng 10 mA đến 100 mA

Good luck!

 

[Cao Xuân Hiếu]

Cám ơn bạn phuongnd, có điều tôi ko hiểu ý bạn trong câu này. Buffer mà bạn có phải là buffer để hoà tan sample dùng để điện di ko?

Dùng chung một buffer system, hoặc buffer concentration giữa các sample không quá chênh lệch, phải dialysis
trước khi load

Nếu tôi hiểu đúng, thì ngoài SDS-sample loading buffer, ng ta còn sử dụng các hệ buffer nào khác để làm việc này?

Khi chạy điện di, cường độ dòng điện đựoc giữ cố định, chứ không phảo là hiệu điện thế, do vậy tùy trường hợp
bạn có thể giữ khoảng 10 mA đến 100 mA

trường hợp này là bạn chạy bao nhiêu bản gel trong 1 bể điện di. ?Khi tôi chạy bản điện di đứng cho khoảng 8 đến 10 gel kích thước 24cmx24cm thì tôi thường set up tối đa Voltage (300V), tối đa dòng điện (250mA) và chạy ổn định bằng giá trị Watt chia đều cho số bản gel.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Nếu loading buffer của tôi là x2 thì khi trộn với sample của tôi có phải là tỉ lệ 1:1 không? Như vậy nồng độ SDS sẽ là 1% phải không? Tôi đọc đâu đó nghe nói nồng độ SDS 0,1% thì sẽ đảm bảo tỉ lệ khối lượng:điện tích là hằng (2), như vậy mới đảm bảo protein thuần túy tách nhau bằng kích thước.
Người ta thường load vào giếng từ 10ug đến 20 ug nhưng chắc máy spectrophotometer của họ tốt chứ ở chỗ tôi làm thấy mấy em đo nồng độ protein cao lắm nhưng chạy không pha loãng cũng chẳng thấy gì.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Gửi ngày: 04/07/2005

--------------------------------------------------------------------------------

Agarose và cả Acrylamide dùng để điện di DNA, Acrylamide có khả năng tách các đọan DNA có kích thước nhỏ hơn.
1. Tại sao mình không thấy sử dụng Agarose để điện di Protein?
2. Điện di Protein thì sủ dụng buồng điện di dạng đứng?
3. Gel polyacrylamide sử dụng cho buồng điện di dạng đứng?
4. Gel agarose sử dụng cho buồng điện di dạng ngang?
Trả lời giúp mình với nhé!
Chân thành cảm ơn. ?
1. Vì lỗ trên gel Agarose to quá, khả năng điều chỉnh lỗ của Acrylamide tốt hơn nhiều (gần như tỉ lệ nghịch với hàm lượng Acrylamide)
2,3,4: Acrylamide đổ ?gel mỏng, cần đổ trong khuôn gồm 2 tấm kính kẹp lại nên cần chạy dạng đứng (ngoài ra còn thêm vấn đề load mẫu gì đó mà hiện tại không nhớ ra được). Rồi còn 2 buồng trên và dưới (Agarose chạy trong cùng 1 buồng). ?Nói chung chạy ngang thì đỡ phiền hà hơn nhưng vì đảm bảo các yếu tố trên nên phải chạy đứng.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

a, quên vụ chạy điện di acrylamide bằng gel đúc sẵn thì chạy kiểu ngang (flatbed) hay kiểu đứng (vertical) cũng đều được. Ví dụ chạy điện di 2 chiều, chạy chiều thứ 2.