Dịch cuốn MOLECULAR BIOLOGY PROBLEM SOLVER

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
The same considerations go into the choice of membrane that go(goes???) into the choice of any other component of your detection strategy (???:eek:).
Cũng cần suy xét như vậy khi lựa chọn màng. Chọn loại màng nào sẽ quyết định việc chọn các thành phần khác cho chiến lược phát hiện của bạn.
 

happyfly

Member
Kháng thể sơ cấp khác nhau phù hợp với tùy loại chất phong bế. Đầu tiên, tốt nhất nên chọn sữa bột không béo, nhưng khi thiết lập phương pháp mới thì phải đánh giá sự phù hợp của các loại chất phong bế.

<o:p></o:p>
Người ta khẳng định rằng một số chất phong bế, như sữa bột không béo, có thể giấu hay che một số loại kháng nguyên. Và chất phong bế tất nhiên cũng không được có thành phần mà có thể phản ứng đặc hiệu với kháng thể sơ cấp hay thứ cấp.

<o:p></o:p>
Một số nhà nghiên cứu thực hiện bước phong bế lần hai (thứ cấp-secondary) trước khi ủ kháng thể thứ cấp. Tuy nhiên, điều này không thật sự cần thiết nếu bước phong bế ban đầu đã hiệu quả và nồng độ chất phản ứng đã được tối ưu.

<o:p></o:p>
Có thể cần tới kiểu phong bế đặc biệt khi sử dụng avidin hay streptavidin làm chất chỉ thị (detection reagent) và mẫu có chứa protein có biotin. Do có “biotin nội sinh”, avidin hay streptavidin sẽ gắn trực tiếp lên protein không mong muốn này. Nếu bạn nghi ngờ rằng sẽ có vấn đề xảy ra, nên thực hiện phản ứng kiểm chứng không sử dụng kháng thể sơ cấp và vẫn dùng avidin hay streptavidin. Băng hiện lên trong mẫu kiểm chứng sẽ chỉ ra liên kết của avidin hay streptavidin với biotin nội sinh.

<o:p></o:p>
Giải pháp cho tình huống này là trước khi ủ kháng thể, hãy xử lý blot với avidin (để liên kết tất cả dạng biotin nội sinh) và sau đó với biotin tự do (để phong bế tất cả những vị trí liên kết tự do trên avidin được bổ sung). Rửa sạch biotin tự do, và tiếp tục thực hiện việc xác định kháng thể (Lydan và O’Day, 1991).

RỬA<o:p></o:p>
Việc rửa triệt để rất quan trọng để có thu được blot sạch, do đó không nên hạn chế thời gian và lượng dung dịch rửa. Một điều quan trọng là nhận ra rằng liên kết protein và tương tác kháng thể không chỉ tồn tại ở trên bề mặt mà trong cả màng. Do đó, việc ngâm và cân bằng màng rất quan trọng trong mọi bước thực hiện.<o:p></o:p>
<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
<o:p></o:p>
Có thể cần tới kiểu phong bế đặc biệt khi sử dụng avidin hay streptavidin làm chất chỉ thị (detection reagent) và mẫu có chứa protein có biotin. Do có “biotin nội sinh”, avidin hay streptavidin sẽ gắn trực tiếp lên protein không mong muốn này. <o:p></o:p>
detection reagent: chất phát hiện

Ở đây avidin hay streptavidin đóng vai trò như secondary antibody.
 

happyfly

Member
Nên luôn rửa tại nhiệt độ phòng và cần rất cẩn thận. Thể thích chính xác của đệm rửa phụ thuộc vào bình rửa, nhưng dịch rửa nên cao khoảng 1cm. Nên thay dịch rửa khi protocol yêu cầu. Độ nhạy phương pháp xác định càng cao thì càng phải cẩn thận trong kỹ thuật rửa.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Bạn nên sử dụng đệm rửa có thành phần như thế nào?<o:p></o:p>
Đệm rửa chuẩn chỉ chứa PBS hay TBS và chất tẩy: Tween 20 thường sử dụng với nồng độ 0.1%, mặc dù có thể tăng tới 0.3% để giảm ảnh hưởng nền. Nồng độ cao hơn có xu hướng làm gãy liên kết kháng thể. Không nên sử dụng Triton, NP-40 và SDS bởi có thể làm gãy liên kết kháng thể và protein đích.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Đôi khi sử dụng phương pháp tăng nồng độ muối trong dịch rửa để tăng hiệu quả rửa. Nồng độ muối cao giảm ảnh hưởng điện tích, làm cho ít đặc hiệu hơn, và tăng tương tác kị nước, làm cho đặc hiệu hơn. Thông thường, nồng độ NaCl tối đa trong đệm rửa là 500mM. (PBS và TBS dạng chuẩn chứa 130mM NaCl.)<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Kích thước, dạng, kỹ thuật thao tác màng lai (blot) thông thường là như thế nào?<o:p></o:p>
Màng lai nhỏ, hay miếng nhỏ cắt từ mảng lớn để phân tích với nhiều loại kháng thể, có thể ủ trong ống ly tâm hay khay cấy chuyên dụng. Nên ủ màng lai lớn trong khay. Ống li tâm khá tiện và chỉ cần lượng nhỏ chất phản ứng. Với khay, để phong bế triệt để hay cung cấp đủ lượng kháng thể thì phải làm ngập hoàn toàn màng lai và cho phép nó có thể di chuyển tự do trong dung dịch.


<o:p></o:p>
Không được hạn chế thể tích dịch rửa (Be generous, however, with volumes of stripping and washing solutions). Phải luôn luôn cẩn thận khi ủ và rửa. Nên dùng con lăn dạng ống hay bản nghiêng khi làm việc với ống. Nên có máy lắc với tốc độ phù hợp khi làm việc với khay. Thường ủ kháng thể trong 30 phút tới 1 tiếng tại nhiệt độ phòng; tuy nhiên có thể để qua đêm tại 4°C. Nếu ủ qua đêm thì nồng độ kháng thể sử dụng nhỏ hơn và trong một số trường hợp có tăng về độ nhạy. Quan trọng là nồng độ kháng thể tối ưu dưới cùng điều kiện ủ sẽ được sử dụng trong quy trình cuối cùng.<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Không bao giờ dùng tay để di chuyển màng. Tốt nhất là sử dụng kẹp và đeo găng tay không có bột. Có nhiều bằng chứng chứng tỏ rằng bột trong găng có thể che tín hiệu huỳnh quang hóa học (Amersham Pharmacia Biotech, 1998). Có thể bảo quản màng lai trong đệm tại 4°C qua đêm ngay sau khi chuyển. Cách khác là có thể thực hiện bước phong bế qua đêm tại 4°C. Không nên để màng lai ướt trong quá ngày do vi khuẩn có thể phát triển. Sau khi chuyển hay tách (strip- loại kháng thể khỏi màng), có thể làm khô màng lai trong không khí và bảo quản trong bình kín ở 4°C. Tách trước khi làm khô trong không khí nếu bạn định tái dò do không thể tách được kháng thể đã khô Do not air-dry blots without stripping them first if you intend to reprobe:dried-on antibody is almost impossible to strip.

<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
KHÁNG THỂ SƠ CẤP<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Có phải tất cả các kháng thể đều phù hợp cho việc lai?<o:p></o:p>
Việc lai thành công phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng kháng thể sơ cấp. Không phải tất cả các kháng thể sơ cấp phản ứng với protein đích trong dung dịch sẽ phản ứng với đúng protein đấy khi nó đã liên kết với màng. Sau quá trình điện di và chuyển, protein có thể biến tính và thoái hóa. Sự thay đổi này có thể làm nó không phản ứng với kháng thể, đặc biệt là loại đơn dòng. Trước khi bắt đầu, bạn nên chắc chắn rằng kháng thể sơ cấp định sử dụng phải phù hợp với việc lai. Có thể biết được điều này từ nơi cung cấp kháng thể, hay kiểm tra bằng cách làm thí nghiệm kiểm chứng.

<o:p></o:p>
Có thể sử dụng kháng thể đa dòng như huyết thanh thô pha loãng, nhưng trong nhiều trường hợp (đặc biệt với huyết thanh độ chuẩn thấp, especially with low titer sera) sử dụng của một phần cấu trúc Ig có thể giảm ảnh hưởng nền. Lý tưởng là có tinh sạch về ái lực nhưng không phải điều này lúc nào cũng khả thi (Affinity purification is ideal, though not always feasible). Có thể sử dụng tinh sạch hiệu quả bằng nhôm sulfate (Ammonium sulfate).

<o:p></o:p>
Cần các yêu cầu tinh sạch như nhau đối với kháng thể đơn dòng, nhưng do lượng cung cấp nhỏ, đặc biệt với nguồn thương mại, sự tinh sạch không phải lúc nào cũng thiết thực. Bạn phải hiểu isotype kháng thể sơ cấp của mình để có thể chọn chất phản ứng thứ cấp phù hợp. Người ta ít dùng IgM làm kháng thể sơ cấp bởi chúng rất khó tinh sạch và đòi hỏi chất phản ứng thứ cấp chuyên dụng.

<o:p></o:p>
Nên sử dụng và bảo quản kháng thể như thế nào?<o:p></o:p>
Nên chia kháng thể kháng huyết thanh và đơn dòng thành những lượng nhỏ, làm lạnh nhanh bằng cách nhúng vào ethanol/đá khô hay nitơ lỏng, và giữ ở -70°C. Chúng sẽ được bảo quản tốt trong nhiều năm dưới điều kiện này. Khi đã tan, không nên làm đông và làm tan lại mà nên giữ ở 4°C. Huyết thanh và kháng thể đơn dòng đã tinh sạch bền nếu giữ ở 4°C (có thể giữ được tới một năm), nhưng dịch ascite (cổ trướng?) có thể chứa protease, nên không được giữ ở 4°C. Quá trình đông-tan lặp lại có khả năng làm cho kháng thể kết tụ và bất hoạt. Có thể dùng chất bảo quản là natri azide (sodium azide) nồng độ 0.02%.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Do not air-dry blots without stripping them first if you intend to reprobe:dried-on antibody is almost impossible to strip.
<o:p></o:p>
Có thể sử dụng kháng thể đa dòng như huyết thanh thô pha loãng, nhưng trong nhiều trường hợp (đặc biệt với huyết thanh độ chuẩn thấp, especially with low titer sera) sử dụng của một phần cấu trúc Ig có thể giảm ảnh hưởng nền. Lý tưởng là có tinh sạch về ái lực nhưng không phải điều này lúc nào cũng khả thi (Affinity purification is ideal, though not always feasible).
<o:p></o:p>
Khi đã tan, không nên làm đông và làm tan lại mà nên giữ ở 4°C. Huyết thanh và kháng thể đơn dòng đã tinh sạch bền nếu giữ ở 4°C (có thể giữ được tới một năm), nhưng dịch ascite (cổ trướng?) có thể chứa protease, nên không được giữ ở 4°C. <o:p></o:p>
Do not air-dry blots without stripping them first if you intend to reprobe:dried-on antibody is almost impossible to strip

Nếu muốn tái dò (reprobe) thì không được để màng bị khô trong không khí trước khi tách loại kháng thể (strip) vì
không thể loại kháng thể nằm khô trên màng .

low titer sera: huyết thanh chuẩn độ thấp (ý là có ít kháng thể)

Affinity purification is ideal, though not always feasible: một cách lý tưởng là dùng kháng thể đã tinh sạch bằng phương pháp ái lực tuy nhiên điều này không phải lúc nào cũng khả thi.


 

happyfly

Member
Nên pha loãng kháng thể trong dung dịch đệm chứa protein mang (carrier protein). Nồng độ làm việc của kháng thể trong dung dịch nhỏ tới mức mà nếu không bổ sung chất mang kháng thể sẽ mất gần hết do bám vào thành bình chứa. Có thể dùng BSA 0.1%. Không nên sử dụng sữa bột không béo do nó không sạch như albumin chất lượng PTN và chỉ kích thích sự phát triển của vi khuẩn.

<o:p></o:p>
CHẤT PHẢN ỨNG THỨ CẤP<o:p></o:p>
Có nhiều loại chất phản ứng thứ cấp để xác định kháng thể sơ cấp. Ngoài kháng thể thứ cấp còn có protein liên kết globulin miễn dịch Protein A và Protein G hay avidin và streptavidin. Một số trường hợp áp dụng được tất cả chất phản ứng thứ cấp. Nói chung chất phản ứng thứ cấp không ổn định như kháng thể sơ cấp do chỉ giữ được hoạt tính liên kết kháng thể mà không giữ hoạt tính reporter. Thực tế, tính ổn định của nhóm reporter quyết định độ ổn định của kháng thể thứ cấp. Phức iot hóa ổn định trong vài tuần, trong khi phức enzyme điển hình có thể ổn định trong vài tháng. Không nên làm đông chất phản ứng, do việc đông tan lặp lại sẽ làm cho reporter kết tụ hay bất hoạt. Tuy nhiên nhiều phòng thí nghiệm đã có kết quả tốt khi làm lạnh nhanh phức enzyme và giữ trong những phần nhỏ ở -70°C.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Sự đặc hiệu loài của chất phản ứng thứ cấp quan trọng như thế nào?<o:p></o:p>
Loài để thu kháng thể thứ cấp thường không quan trọng – thường sử dụng dê và khỉ do dễ thu được lượng lớn huyết thanh. “Dê kháng thỏ” là kháng thể tạo thành kháng lại Ig của thỏ bằng cách gây miễn dịch cho dê.

<o:p></o:p>
Nên tinh sạch kháng thể thứ cấp sử dụng cho lai thấm bằng phương pháp ái lực: thí dụ phải chạy kháng huyết thanh thô kháng thỏ của dê (raw goat anti-rabbit antiserum) qua cột chứa Ig thỏ miễn dịch. Tất cả các chất trong huyết thanh không liên kết với Ig thỏ sẽ được loại bỏ khi đi qua cột. Kháng thể thứ cấp có tinh sạch ái lực sẽ có ít protein hơn nhiều so với huyết thanh thô: protein không liên quan sẽ chỉ làm tăng nền chứ không làm tăng tín hiệu xác định.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Nói chung chất phản ứng thứ cấp không ổn định như kháng thể sơ cấp do chỉ giữ được hoạt tính liên kết kháng thể mà không giữ hoạt tính reporter.

<o:p></o:p>
Nên tinh sạch kháng thể thứ cấp sử dụng cho lai thấm bằng phương pháp ái lực: thí dụ phải chạy kháng huyết thanh thô kháng thỏ của dê (raw goat anti-rabbit antiserum) qua cột chứa Ig thỏ miễn dịch. Tất cả các chất trong huyết thanh không liên kết với Ig thỏ sẽ được loại bỏ khi đi qua cột. Kháng thể thứ cấp có tinh sạch ái lực sẽ có ít protein hơn nhiều so với huyết thanh thô: protein không liên quan sẽ chỉ làm tăng nền chứ không làm tăng tín hiệu xác định.<o:p></o:p>
reporter: chất báo cáo, chất chỉ thị
raw goat anti-rabbit antiserum: huyết thanh dê thô kháng thỏ:eek:
 

happyfly

Member
Western blot overview

(dịch từ http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot và sẽ tìm hiểu chi tiết sau) <o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Western Blot (còn có cách gọi khác là blot miễn dịch) là phương pháp phân tích sử dụng để phát hiện protein trên mẫu mô hay dịch chiết mô (tissue homogenate or extract). Phương pháp này sử dụng điện di để phân tách protein còn nguyên vẹn hay đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide (trong điều kiện biến tính) hoặc bằng cấu trúc ba chiều của protein (khi còn nguyên vẹn hay không biến tính). Sau đó chuyển protein này lên màng (thường sử dụng là nitrocellulose hay PVDF), ở đó chúng được gắn (xác định) bằng kháng thể đặc hiệu với protein đích.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Có nhiều công ty hóa chất chuyên cung cấp kháng thể (cả loại đơn dòng và đa dòng) tương ứng với hàng ngàn protein khác nhau. Kháng thể thương mại thường có giá thành cao mặc dù có thể tái sử dụng kháng thể không liên kết giữa các lần thí nghiệm. Phương pháp này được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, hóa sinh, hay miễn dịch gen (immunogenetics).<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Những kỹ thuật liên quan khác có sử dụng kháng thể để xác định protein trên mô hay tế bào bằng cách nhuộm miễn dịch (immunostaining) hay ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay-hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme).<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phương pháp này bắt nguồn từ phòng thí nghiệm của George Stark tại Stanford. W. Neal Burnette đặt tên western blot cho kỹ thuật này dựa trên tên Southern blot, một kỹ thuật xác định DNA phát triển bởi Edwin Southern. Northern blot là kỹ thuật xác định RNA.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Các bước thực hiện trong Western blot<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Chuẩn bị mô<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Nên lấy mẫu từ toàn bộ mô hay canh trường tế bào. Trong hầu hết các trường hợp, thường xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học có dụng cụ/máy nghiền (blender) (khi lượng mẫu lớn), hay máy đồng hóa (homogenizer), hoặc siêu âm (sonication). Cũng có thể phá tế bào bằng phương pháp cơ học như trên. Tuy nhiên, lưu ý rằng những mẫu vi khuẩn, virus hay mẫu lấy từ môi trường cũng có thể là nguồn protein xác định được trong western blot, không bắt buộc phải là nghiên cứu về tế bào.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Có thể sử dụng các loại chất tẩy, muối và đệm để thúc đẩy ly giải tế bào và làm tan protein. Thường bổ sung chất kìm hãm protease và phosphatase để ngăn chặn phân hủy mẫu bằng chính enzyme có trong mẫu. Nên thực hiện chuẩn bị mô tại nhiệt độ thấp để tránh biến tính protein.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phối hợp kỹ thuật hóa sinh và cơ học – bao gồm nhiều phương pháp lọc, ly tâm để phân tách thành phần tế bào và loại bào quan khác nhau.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Điện di<o:p></o:p>
Điện di để phân tách protein trong mẫu. Sự phân tách này dựa trên điểm đẳng điện (isoelectric point - pI), khối lượng phân tử, điện tích, hoặc phối hợp các yếu tố trên. Đặc điểm của quá trình phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu và đặc điểm của bản gel.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Cho tới nay, phương pháp điện di sử dụng phổ biến nhất là gel polyacrylamide và đệm tải là sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS –PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) giữ polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng đã bị xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2 bậc 3 (thí dụ, cầu disulfide) và do đó phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử. Protein trong mẫu mang điện tích âm SDS và dịch chuyển tới cực dương qua mạng acrylamide bản gel. Protein nhỏ di chuyển nhanh hơn và do đó chúng được phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilo <st1:city><st1:place>Daltons</st1:place></st1:city>, kDa). Nồng độ acrylamide xác định khả năng phân tách (độ phân giải) của bản gel – nồng độ càng cao thì phân tách càng tốt protein có khối lượng phân tử nhỏ. Protein chỉ di chuyển theo một hướng dọc theo bản gel trong hầu hết các màng lai.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Mẫu được tải lên giếng. Thường để lại một giếng cho thang (marker hay ladder), là sản phẩm thương mại chứa các protein với khối lượng phân tử xác định, được nhuộm để tạo ra băng màu và nhìn thấy được. Khi điện thế được thiết lập trên gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác nhau. Tốc độ khác nhau này sẽ tạo thành vạch khác nhau trên mỗi giếng.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Cũng có thể sử dụng gel 2 chiều (two-dimensional (2-D) gel) để phân tách protein từ một mẫu theo hai chiều. Theo chiều thứ nhất, protein được phân tách theo điểm đẳng điện (pH tại đó protein không mang điện tích) và chiều thứ hai theo khối lượng phân tử của protein.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Chuyển lên màng lai<o:p></o:p>
Để kháng thể có thể xác định được thì protein phải được chuyển từ gel lên màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene diflouride (PVDF). Đặt màng lên mặt bản gel rồi đặt một tấm giấy lọc tiếp lên trên. Đặt cả bộ trong dịch đệm, dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng lực mao dẫn, và mang theo cả protein. Có thể chuyển protein bằng phương pháp khác gọi là electroblot và sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF hay nitrocellulose. Protein di chuyển từ gel lên màng và vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết quả của quá trình lai thấm này là protein được phơi ra trên lớp mỏng để thực hiện xác định (như sẽ trình bày). Cả hai loại màng này bởi đặc tính liên kết protein không đặc hiệu (khả năng liên kết với tất cả protein là tương đương). Liên kết protein dựa trên tương tác khị nước, cũng như tương tác điện tích giữa màng và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn màng PVDF, nhưng dễ vỡ và không bền nếu tái dò.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Có thể kiểm tra sự đồng nhất và hiệu quả cuối cùng của quá trình chuyển protein từ gel lên màng bằng cách nhuộm màng với Coomassie hay Ponceau S. Thường sử dụng Ponceau S hơn bởi nó có độ nhạy cao và tính tan trong nước làm cho dễ rửa chất nhuộm và dò màng như sẽ mô tả trong phần sau.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phong bế<o:p></o:p>
Bởi chọn màng do nó có khả năng liên kết với protein, cả kháng thể và protein đích đều là protein nên cần thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể sử dụng để xác định protein đích. Phong bế các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng – điển hình là albumin huyết tương bò (Bovine serum albumin (BSA)) hay sửa bột không béo (đều có giá thành thấp) với phần nhỏ chất tẩy như Tween 20. Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa bám vào. Do đó, khi bổ sung kháng thể, sẽ không còn chỗ trên màng để nó bám vào ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này giảm “nhiễu” trong sản phẩm cuối của Western blot, cho kết quả rõ ràng và loại trừ dương tính giả.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phát hiện<o:p></o:p>
Trong quá trình phát hiện màng được “dò” protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi mà có khả năng liên kết với enzyme thông báo. Enzyme này tác dụng với cơ chất tương ứng tạo phản ứng màu. Có nhiều nguyên nhân dẫn tới điều này thường diễn ra trong quá trình hai bước mặc dù phương pháp xác định một bước vẫn được áp dụng trong một số trường hợp. <o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Hai bước<o:p></o:p>
Kháng thể sơ cấp<o:p></o:p>
Tạo kháng thể sơ cấp khi cho vật chủ hay canh trường tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm (hay một phần của nó). Thông thường, đây là phần trong đáp ứng miễn dịch. Kháng thể thu nhận và sử dụng là một công cụ xác định đặc hiệu mà có thể liên kết trực tiếp với protein.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Sau khi phong bế, ủ dịch loãng kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ 0.5 and 5 micrograms/ml) với màng và có lắc nhẹ. Tiêu biểu là dung dịch này gồm dịch muối đệm với lượng nhỏ chất tẩy và đôi khi có sữa bột hay BSA. Có thể giữ dịch kháng thể và màng và ủ cùng một nơi trong thời gian 30phút tới qua đêm. Cũng có thể ủ ở nhiệt độ khác, nhiệt độ càng cao càng kích thích liên kết, cả liên kết đặc hiệu (protein đích) và không đặc hiệu (nhiễu).<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Kháng thể thứ cấp<o:p></o:p>
Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, tiếp tục gắn kháng thể thứ hai, bám trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài của kháng thể sơ cấp. Kháng thể này được biết tới là kháng thể thứ cấp và do đặc điểm hướng đích, kháng thể thứ cấp có xu hướng được đưa ra dưới dạng "kháng chuột" "kháng thỏ”, v.v. Kháng thể thu từ nguồn động vật (hay canh trường khối tế bào lai động vật); kháng thể kháng chuột sẽ liên kết với bất kỳ kháng thể sơ cấp nào có nguồn gốc từ chuột. Điều này cho phép tiết kiệm chi phí cho toàn phòng thí nghiệm bởi có thể dùng chung một nguồn kháng thể và cho kết quả ổn định theo thời gian. Cũng thường liên kết kháng thể thứ cấp với biotin hay một enzyme như alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase. Điều này có nghĩa là có nhiều kháng thể sơ cáp sẽ liên kết với kháng thể sơ cấp và khuếch đại tín hiệu.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phổ biến nhất là sử dụng kháng thể gắn horseradish peroxidase trong liên kết với chất huỳnh quang hóa học, và sản phẩm phản ứng phát ra huỳnh quang tỉ lệ với lượng protein. Có thể thu được hình ảnh này trên film ảnh.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Như với quy trình ELISPOTELISA, cơ chất phản ứng với enzyme tạo màu nhìn trên màng.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phương pháp thứ bai là sử dụng dấu phóng xạ thay vì enzyme đi kèm với kháng thể thứ cấp, như gắn protein liên kết kháng thể như Protein A của Staphylococcus với đồng vị phóng xạ iot. Do các phương pháp khác đều an toàn, nhanh và rẻ hơn nên rất ít sử dụng phương pháp này.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Một bước<o:p></o:p>
Quá trình dò được thực hiện theo hai bước bởi tạo ra kháng thể sơ cấp và thứ cấp trong các quá trình riêng biệt là tương đối dễ. Điều này mang lại cho nghiên cứu viên và các tổ chức nhựng ưu điểm như linh động và bổ sung bước khuyếch đại trong quá trình xác định. Tiến bộ của protein hiệu năng cao và những hạn chế giảm đi trong xác định được đưa ra, nhưng người ta vẫn quan tâm tới việc phát triển hệ thống dò một bước mà cho phép việc xác định diễn ra nhanh hơn và ít tốn kém hơn. Điều này cần tới kháng thể dò vừa có khả năng nhận ra protein quan tâm vừa chứa nhãn có thể xác định, đầu dò thường được biết tới dưới dạng gọi là đuôi protein. Ủ đầu dò sơ cấp với màng theo cách tương tự như với kháng thể sơ cấp trong quá trình hai bước, sau đó sẵn sàng để xác định trực tiếp sau khi rửa nhiều lần. <o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phân tích<o:p></o:p>
Sau khi rửa loại kháng thể không gắn lên màng cũng là lúc màng lai đã sẵn sàng để xác định đầu dò mà đã đánh dấu và liên kết với protein quan tâm. Trong thực tế, không phải tất cả western đều biểu hiện protein chỉ tại một băng trên màng. Khối lượng xác định gần đúng bằng cách so sánh băng nhuộm với thang đo khi điện di. Quá trình này cũng được thực hiện đối với protein cấu trúc, như actin hay tubulin, mà protein dạng này không nên thay đổi giữa các mẫu. Lượng protein đích được chỉ tương ứng với protein cấu trúc để kiểm chứng giữa các nhóm. Thực hành chắc chắn rằng tổng lượng protein trên màng là đúng trong trường hợp có sai sót hay việc chuyển không hoàn thiện.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Xác định màu<o:p></o:p>
Phương pháp xác định màu phụ thuộc vào quá trình ủ của western blot với cơ chất phản ứng với enzyme để chỉ thị (như peroxidase) có liên kết với kháng thể thứ cấp. Nó sẽ chuyển chất nhuộm tan thành dạng không tan hiện màu kết tủa ngay tại vị trí enzyme gắn và do đó làm màng hiện màu. Quá trình hiện màu dừng lại bằng cách rửa chất nhuộm tan. Đánh giá biểu hiện protein bằng mật độ kế (densitometry) (nhuộm đậm tới mức nào) hay quang phổ kế (spectrophotometry)<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Xác định phát quang hóa học<o:p></o:p>
Phương pháp xác định bằng phát quang hóa học phụ thuộc và quá trình ủ trong western blot với cơ chất phát quang khi phơi chất chỉ thị gắn trên kháng thể thứ cấp. Ánh sáng phát ra thu được bằng film ảnh, hoặc máy chụp CCD mà có thể bắt được ảnh kĩ thuật số của màng lai. Hình ảnh này phân tích bằng mật độ kế, máy đo lượng tương đối protein nhuộm và định lượng kết quả theo mật độ quang. Phần mềm mới có khả năng phân tích tín hiệu khác như khối lượng phân tử nếu sử dụng đúng loại chất chuẩn.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Xác định phóng xạ<o:p></o:p>
Phương pháp đánh dấu phóng xạ không cần cơ chất enzyme, nhưng phải đặt film X quang trực tiếp trước màng lai như phơi nó lên dấu phóng xạ và tạo vùng tối mà tương ứng với băng protein quan tâm. Chi phí cao, ảnh hưởng tới sức khỏe và an toàn của người sử dụng và thường thay thế bằng ECL (Còn có ưu điểm là: The importance of radioactive detection methods is declining? à Coming soon)<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Xác định huỳnh quang<o:p></o:p>
Đầu dò đánh dấu huỳnh quang kích thích bằng ánh sáng và xác định ánh sáng phát ra bằng cảm biến quang như máy CCD được trang bị với bộ lọc ánh sáng tương ứng. Máy CCD sẽ thu ảnh kỹ thuật số của màng lai và có thể tiến hành phân tích sâu hơn về khối lượng phân tử hay định lượng trên màng lai. Ảnh huỳnh quang là một trong những phương pháp nhạy nhất để phân tích màng lai.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Dò thứ cấp<o:p></o:p>
Khác biệt lớn giữa màng nitrocellulose và PVDF liên quan tới khả năng hỗ trợ việc tách loại kháng thể và tái sử dụng màng cho kháng thể khác. Trong khi có nhiều quy trình tốt thiết lập để tách loại kháng thể trên màng nitrocellulose, PVDF lại dễ thực hiện việc tách loại này hơn và tái sử dụng nhiều hơn trước khi thí nghiệm ảnh hưởng bởi nhiễu trên nền. Một điểm khác nữa là không như nitrocellulose, phải lắc PVDF trong cồn 95%, isopropanol hay methanol trước khi sử dụng. Màng PVDF thường dày hơn và bền hơn trong quá trình sử dụng.<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Thường chỉ thực hiện tinh sạch khi cần chắc chắn đặc hiệu loài. Hấp thụ chéo (cross-adsorption) đề cập trong phần trên là phương pháp trái ngược với tinh sạch ái lực. Cho Ig kháng thỏ chạy qua cột chứa thí dụ là Ig chuột. Khi đi qua cột, các chất không liên kết sẽ được thu lại và giữ bất kỳ kháng thể có phản ứng với Ig chuột. Có thể lặp lại quá trình này với các cột chứa Ig của nhiều loài khác nhau để chắc chắn rằng kháng thể thu được chỉ phản ứng với Ig của một loài. Tùy theo đặc điểm nghiên cứu của bạn mà sự đặc hiệu loài có quan trọng hay không. Nếu trong mẫu không có Ig từ loài khác, điều này không thực sự cần thiết. Hơn nữa, không có chất phản ứng thứ cấp hấp thụ chéo nào đặc hiệu loài hoàn toàn: có tương đồng giữa các loài nên kháng thể hấp thụ chéo sẽ giữ Ig ngoại lai nếu có thể (Furthermore no cross-adsorbed secondary reagent is completely species specific: there is enough homology between species that even a cross-adsorbed antibody will pick up a “foreign” Ig if enough of it is present). Hoàn toàn không thể thu chất phản ứng thứ cấp 100% đặc hiệu loài, lớp, hay isotype, bởi vì luôn có sự tương đồng giữa cái cần và không cần ở cấp độ nào đó. <o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Tại sao trong một số trường hợp sử dụng mảnh F làm kháng thể thứ cấp?<o:p></o:p>
Trong lai thấm, mảnh F thường không có ưu điểm. Trường hợp ít thấy mà có sử dụng mảnh F là với mẫu chứa thụ thể Fc (khi làm việc với một số vi khuẩn và bạch huyết bào): mảnh F làm giảm liên kết nền của kháng thể với những thụ thể này thông qua phần Fc.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Protein A và Protein G<o:p></o:p>
Protein A và Protein G là protein vi khuẩn liên hết đặc hiệu với globulin miễn dịch của nhiều loài khác nhau. Bảng 13.3 đưa ra một số globulin miễn dịch thường dùng và tác dụng. Tại sao sử dụng Protein A và Protein G thay vì kháng thể thứ cấp? Kháng thể thứ cấp đặc hiệu loài thường có tín hiệu mạnh hơn và đặc hiệu hơn Protein A hay G. Ưu điểm của Protein A hay G chính là tính linh hoạt: đây là chất phản ứng thứ cấp có thể sử dụng cho nhiều loại kháng thể sơ cấp. Điều này đóng vai trò quan trọng trong phương pháp xác định phóng xạ do phải bổ sung liên tục nhiều kháng thể thứ cấp khác nhau do bị phân hủy bởi phóng xạ. <o:p></o:p>
<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Avidin và Streptavidin<o:p></o:p>
Avidin tách từ lòng trắng trứng, streptavidin là protein vi khuẩn có khả năng liên kết với biotin với ái lực và độ đặc hiệu cao. Sử dụng avidin và streptavidin để xác định kháng thể sơ cấp đã tạo phức hóa trị với biotin gắn trên màng lai. Người ta có cung cấp thương mại phức chất avidin và streptavidin. Bởi có thể sử dụng phức avidin và streptavidin với bất cứ chất nào đã biotin hóa, avidin và streptavidin ngày càng được sử dụng phổ biến.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Người ta có cung cấp một số loại kháng thể sơ cấp dưới dạng biotin hóa, kit hay hóa chất phản ứng để thực hiện quá trình biotin hóa tại PTN. Thường gắn thông qua este N-hydroxy-succinimidyl, một nhóm chức amino hoạt động (Haugland và You, 1998). Một cách lý tưởng là kháng thể đã đánh dấu không chứa protein mang, do tất cả protein trong dung dịch sẽ tham gia phản ứng. Tiếp đó nên tinh sạch bằng cột hay thẩm tách, điều này có nghĩa là bạn chuẩn bị lượng lớn protein để chắc chắn sẽ thu được lượng đủ dùng. Có thể dùng thay thế giữa avidin và streptavidin. Tuy nhiên, streptavidin không tích điện trong môi trường trung tính và không glycosyl hóa. Do đó, nó có khuynh hướng tạo ít nền và đặc hiệu hơn so với avidin.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Phương pháp biotin/streptavidin rất hữu ích trong việc xác định phân tử lượng. Thang phân tử lượng biotin hóa có cung cấp trên thị trường và có thể chạy trên gel và chuyển trong lai thấm như thang phân tử lượng thông thường. Xử lý màng lai như thường lệ: ủ kháng thể sơ cấp và rửa, nhưng khi ủ kháng thể thứ cấp cần bổ sung streptavidin đã đánh dấu vào dung dịch để việc ủ kháng thể thứ cấp (để liên kết với kháng thể sơ cấp) và streptavidin (để liên kết với thang biotin hóa) diễn ra đồng thời. Streptavidin nên gắn nhóm chỉ thị tương tự như kháng thể thứ cấp. Bằng cách này, cả thang phân tử lượng và băng quan tâm sẽ cùng biểu hiện trên màng lai mà không phải cắt màng lai thành nhiều mảnh. Việc xác định phân tử lượng bằng điện di cũng gần như thế.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
SỰ KHUYẾCH ĐẠI<o:p></o:p>
Người ta sử dụng nhiều phương thức để tăng tín hiệu trên Western blot bằng cách tăng lượng nhóm chỉ thị liên kết với lượng protein đích đã có. Nếu kháng thể sơ cấp liên kết với protein đích tạo ra liên kết với 50 phân tử HRP, thay vì chỉ có 2 hay 3, sẽ làm tăng tín hiệu một cách rõ rệt.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Người ta thường thực hiện cách này trong hệ thống biotin-streptavidin. Đơn giản nhất là hệ thống ba lớp: kháng thể sơ cấp - kháng thể thứ cấp biotin hóa - chỉ thị streptavidin. Điều này có nghĩa là liên kết của lớp thứ 2 và 3 diễn ra trên tương tác không tương ứng một – một; lớp bổ sung này có tác dụng khuếch đại tương tác. Cũng có thể thực hiện ý tưởng tương tự bằng nhóm chỉ thị đặc biệt: thí dụ enzyme phức (multimeric complexes of enzyme Protein complex:dạng protein/enzyme có cấu trúc gồm nhiều loại protein khác nhau, là một cấu trúc của protein có cấu trúc bậc 4 như Hemoglobin) có cung cấp trên thị trường. Ý tưởng ban đầu là làm thế nào để một phân tử kháng thể sơ cấp liên kết với càng nhiều nhóm chỉ thị càng tốt. <o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Trước khi trở nên phổ biến, hệ thống xác định phát quang hóa học chỉ được sử dụng khi cần độ nhạy cao. Phương pháp khuyếch đại vẫn được dùng để tăng độ nhạy trong hệ thống tạo màu hay cũng có thể phối hợp với hệ thống phát quang hóa học. Nhưng trong trường hợp này độ nhạy tăng và cũng tạo nhiều nền hơn: việc tối ưu ba lớp là rất phức tạp và đòi hỏi khắt khe.

TÁCH LOẠI KHÁNG THỂ VÀ TÁI DÒ
Việc có thể xác định với nhiều kháng thể trên cùng màng lai có ưu điểm. Điều này thực hiện bằng cách tách loại kháng thể khỏi màng lai sau khi xác định xong để tái dò với hệ kháng thể mới. Việc tách loại chỉ khả thi khi hệ thống xác định không để lại kết tủa trên màng lai do đó phương pháp tạo màu và phát quang hóa học không thực sự phù hợp. (Việc tách loại chỉ thực hiện được sau khi xử lý với dung môi hữu cơ để làm tan chất kết tủa, nhưng người ta không khuyến khích việc này do màng có khả năng chống chịu với dung môi khác nhau và việc xác định sau đó thường không thành công.) Cách khác sử dụng trong trường hợp không tách loại được là chạy nhiều giếng cùng loại trên cùng bản gel, cắt màng lai thành nhiều mảnh sau khi chuyển và xác định với nhiều loại kháng thể khác nhau

Tách loại kháng thể có ảnh hưởng tới protein đích hay không?
Tách loại rất hữu ích nhưng cũng có nhiều hạn chế. Xử lý để tách kháng thể cũng có thể đủ mạnh để phá hủy và tách loại cả protein đích. Do đó không thể tránh khỏi việc mất đi một số protein đích sau mỗi lần tách loại kháng thể. Đôi khi xử lý đơn giản cũng có thể làm mất hoàn toàn protein đích (hoặc ít nhất cũng ảnh hưởng tới khả năng phản ứng miễn dịch của nó). Trong trường hợp khá hơn, protein đích sẽ mất 25% hoặc hơn cho mỗi lần tách loại kháng thể. Do đó, nên dò protein đích có lượng nhỏ nhất đầu tiên, và sau đó chuyển sang protein với lượng nhiều hơn để có thể chịu được mất mát nhiều hơn.

Kĩ thuật tách loại kháng thể phổ biến nhất có sử dụng 2% SDS, 100mM 2-mercaptoethanol (2-ME) hoặc dithiothreitol (DTT) và đun nóng trong 50 - 65°C, và thường có nắp hơi (Amersham Pharmacia Biotech, 1998). Phương pháp này khá hiệu quả nhưng làm mất protein đích một cách rõ rệt. Người ta cũng có thể ủ tại nhiệt độ phòng trong đệm glycine pH2. Điều kiện này êm dịu hơn nhưng thường không hiệu quả như phương pháp trên. Với cả hai phương pháp thì sau đó đều phải rửa thật kỹ. Cần phong bế lại vì xử lý tách loại kháng thể thường làm mất chất phong bế. Kiểm tra hiệu quả của việc tách loại kháng thể bằng cách lặp lại việc ủ kháng thể thứ cấp và các bước xác định (không với kháng thể sơ cấp). Nên thử phương pháp tách loại bên ngoài trước khi thực hiện để chắc chắn rằng về hiệu quả hoạt động của nó.

Có thể sử dụng quy trình tách loại như nhau cho màng từ các nhà sản xuất khác nhau hay không?
Trong hầu hết các trường hợp, có thể áp dụng quy trình như nhau cho màng cùng loại từ các nhà sản xuất khác nhau. Màng có đặc tính duy nhất sẽ có protocol tiêu chuẩn đi kèm.

Có cần tách loại kháng thể trước khi tái dò hay không?
Có nhiều trường hợp có thể tái dò màng lai mà không cần tách loại kháng thể. Khi sử dụng peroxidase là chất chỉ thị trong phương pháp phát quang hóa học, có thể xử lý màng lai với oxi già pha loãng (30 phút trong H2O2 15%, sau đó rửa sạch). Gốc tạo thành trong phản ứng peroxidase không làm bất hoạt enzyme. Sau đó, rửa màng lai và xác định với kháng thể sơ cấp khác. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phù hợp khi sử dụng hai chất phản ứng thứ cấp không tương tác với nhau. Mặt khác, chất phản ứng thứ cấp sử dụng trong lần xác định thứ cấp sẽ gắn cả kháng thể sơ cấp ban đầu và kháng thể mới.
 

happyfly

Member
XỬ LÝ SỰ CỐ
Nên coi trọng việc phát triển các chiến lược xử lý sự cố (xem Bảng 13.4). Do luôn tồn tại vấn đề trong quá trình thực nghiệm nên việc thực hiện đường hướng có hệ thống khi xử lý sự cố sẽ tiết kiệm thời gian, năng lượng, và hóa chất. Hình 13.1 – 13.6 có đưa ra thí dụ cho vấn đề thông thường hay bất thường trong quá trình thí nghiệm.

Nguyên tắc cơ bản là chia hệ thống thành phần nhỏ và kiểm tra từng phần độc lập. Điều này không áp dụng cho tất cả các trường hợp nhưng nên được thực hiện. Có thể sử dụng những phần đã đạt tiêu chuẩn để kiểm tra phần khác.

Chú ý khi tín hiệu yếu hay không biểu hiện. Lúc đó, việc đầu tiên là cần xem lại toàn bộ hệ thống của bạn và chắc chắn rằng không tồn tại sự không phù hợp về hóa chất nào. Hóa chất đó có thể không hợp với các loại đệm thông thường hay chất bổ sung trong đệm. Sodium azide kìm hãm mạnh peroxidase. Mặc dù sodium azide thường sử dụng trong bảo quản đệm nhưng không nên hòa chất tiếp hợp peroxidase (peroxidase conjugates) trong đệm có azide, cũng như dùng đệm rửa có azide với chất tiếp hợp peroxidase. Tuy nhiên, azide có mặt ở dịch kháng thể nồng độ cao không phải là vấn đề do azide này sẽ được hòa tan và loại bỏ trước khi áp dụng chất tiếp hợp HRP.

Không nên sử dụng alkaline phosphatase với đệm phosphate và nên thay bằng TRIS. Sự có mặt của nhóm phosphate sẽ kìm hãm phản ứng phosphatase.

Không nên pha avidin và streptavidin trong đệm có sữa bột không béo. Sữa bột không béo chứa biotin tự do. Biotin tự do này sẽ liên kết ái lực cao với avidin hoặc streptavidin, từ đó sẽ ngăn chặn liên kết với kháng thể đã biotin hóa của bạn (Hoffman và Jump, 1989).

Nếu việc lựa chọn hóa chất không có vấn đề gì thì tiếp đó phải xác nhận tất cả hóa chất đều đưa ra tính chất đúng. Trước hết hãy kiểm tra hệ thống xác định. Có thể kiểm tra chức năng của nhiều hệ thống một cách trực tiếp: kiểm tra nhanh chóng hóa chất phát quang hóa học bằng cách bổ sung chất tiếp hợp enzyme vào cơ chất đã được chuẩn bị trong phòng tối và quan sát ánh sáng phát ra. Trong một số hệ thống khác, có thể chấm kháng thể thứ cấp đã pha loãng trực tiếp trên màng và xác định. Kháng thể thứ cấp biểu hiện có nghĩa là đã sử dụng đúng hóa chất.

Phương pháp đã đưa ra cụ thể như nhau: có thể chấm kháng thể sơ cấp lên màng lai đã phong bế, ủ với kháng thể thứ cấp trước đó và thực hiện việc xác định. Điều này sẽ chỉ ra khả năng kháng thể thứ cấp xác định được kháng thể sơ cấp. Nếu đây không phải là vấn đề, có thể pha loãng kháng nguyên đã tinh sạch hoặc lysate theo cấp độ khác nhau (serially diluted), chấm lên màng, thực hiện quá trình ủ và xác định kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp. Điều này sẽ chỉ ra khả năng kháng thể sơ cấp xác định được đích. Nếu đây vẫn không phải là vấn đề, phải kiểm tra việc chuyển lên màng lai. Phân tử có MW xác định có màu không phải lúc nào cũng chỉ thị đúng hiệu quả chuyển lên màng lai của protein đích. Sử dụng chất nhuộm thuận nghịch (reversible stain) như Ponceau S (Salinovich và Montelaro, 1986) là cách tốt nhất để kiểm tra hiệu quả chuyển của protein đích.

Cùng với sự phát triển nhanh chóng các phương pháp xác định có độ nhạy cao, ảnh hưởng nền cũng trở thành vấn đề phổ biến nhất mà chúng ta gặp phải khi thực hiện Western blot. Để giải quyết vấn đề nền hãy dừng thí nghiệm và kiểm tra lại cẩn thận màng lai. Ảnh hưởng nền có hiện trên toàn màng lai (trên cả giếng và khu vực giữa các giếng), hay chỉ giới hạn trong giếng (trên các băng thêm, hoặc cả giếng ở một số trường hợp đều biểu hiện)? (Is the background occurring all over the blot ( i.e., over the lanes and the areas between the lanes), or is it confined to the lanes themselves (i.e.,extra bands,or in some cases,the entire lane showing up)?

Nền trên toàn màng lai chỉ ra ảnh hưởng chung như điều kiện rửa hay phong bế. Hãy kiểm tra lại quy trình của bạn: Rửa đã cẩn thận và triệt để? Sử dụng đủ lượng dung dịch rửa? Nếu việc rửa đã được thực hiện cẩn thận, cần kiểm tra lại điều kiện phong bế. Cuối cùng, nồng độ kháng thể quá lớn có thể gây ra ảnh hưởng nền như trên. Do đó phải tối ưu nồng độ kháng thể.
 

happyfly

Member
Nếu ảnh hưởng nền chỉ biểu hiện trong giếng, nguyên nhân thường do liên kết kháng thể không đặc hiệu. Một lần nữa, hãy chắc chắn rằng bạn đã tối ưu tất cả các nồng độ kháng thể. Để xác định chính xác vấn đề thì bạn nên chạy blot kiểm chứng mà không sử dụng kháng thể sơ cấp. Nếu băng vẫn hiện khi không có kháng thể sơ cấp, vấn đề có thể do kháng thể thứ cấp; hầu hết các trường hợp là do nồng độ kháng thể thứ cấp quá cao. Mặt khác có thể do ái lực của kháng thể thứ cấp với chất có trong mẫu của bạn. Khi đó, cách duy nhất là chuyển sang loại kháng thể thứ cấp mới hay thậm chí đường hướng xác định mới (ví dụ Protein A hay biotin/streptavidin).

Nguyên tắc hướng dẫn xử lý vấn đề đều tương tự như nhau: hãy gắng thu thập càng nhiều thông tin càng tốt về màng lai, phân lập các bước trong quy trình thực hiện, và chỉ thay đổi một biến số mỗi lần thí nghiệm. Giữ lại biến trừ khi thay đổi giá trị này tạo ra kết quả có ý nghĩa. Điều này là một trong những tình huống cho thấy tầm quan trọng của việc lưu trữ dữ liệu một cách chi tiết. Khi hoạt động của hệ thống thay đổi, có thể xem lại nguồn dữ liệu này để tìm ra nguồn gốc vấn đề.

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MỚI
Khi xây dựng phương pháp mới, dường như có quá nhiều yếu tố cần phải thống nhất. Thực tế, điều này không quá khó. Quyết định của bạn khi lựa chọn phương pháp cần dựa trên đặc điểm protein bạn quan tâm, lượng mẫu và đặc điểm mẫu, nhu cầu tái dò hay định lượng, và đặc điểm thiết bị đã có. Nghiên cứu kĩ các tài liệu liên quan, và protocol lúc đầu ít nhất cũng nên dựa trên phương pháp đã công bố.

Khi xây dựng phương pháp mới, một vấn đề quan trọng là tối ưu hóa nồng độ kháng thể. Nồng độ tối ưu khác nhau tùy theo hệ thống sử dụng. Có thể thiết lập đơn giản nhất thông qua blot chấm điểm (dot or slot blots): gắn protein đích (protein dịch tế bào – lysate protein hay protein tinh sạch) và phong bế. Sau đó sử dụng dịch kháng thể thứ cấp đã pha loãng để xác định. (Trước tiên hãy sử dụng nồng độ kháng thể thứ cấp do nhà sản xuất đề nghị.) Nồng độ nhỏ nhất của kháng thể sơ cấp có thể đưa ra được tín hiệu khả dụng sẽ là nồng độ làm việc trong quy trình của bạn.
Lặp lại quy trình tương tự đối với kháng thể thứ cấp, sử dụng nồng độ kháng thể sơ cấp bạn đã có. Tương tự, sẽ chọn nồng độ nhỏ nhất của kháng thể thứ cấp có thể đưa ra tín hiệu khả dụng. Sử dụng nồng độ thấp nhất của kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp sẽ giúp bạn chắc chắn về tính đặc hiệu lớn nhất và ít chịu ảnh hưởng nền nhất (tính trên cùng lượng hóa chất). Khi xem xét điều kiện phong bế và rửa, hãy bắt đầu bằng một phương pháp đã công bố. Nếu phương pháp này được phát triển trên cùng loại protein bạn quan tâm, bạn có thể theo chính xác các điều kiện trong đó. Nếu protein của bạn khác, tác nhân phong bế hiệu quả nhất để bắt đầu là 0.5% sữa bột không béo với 0.1% Tween-20. Nếu bạn gặp ảnh hưởng nền cao hay những kết quả không mong muốn khác, hãy kiểm tra với chất phong bế mới, kiểm tra điều kiện rửa khác, xem xét đưa protein có nồng độ nhỏ hơn lên gel, hay kiểm tra lại nồng độ kháng thể tối ưu.

Báo cáo Hết chương 13. Bác Hưng sửa giúp em đi bác để em còn tổng kết chương này(y)
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Phương pháp đã đưa ra cụ thể như nhau: có thể chấm kháng thể sơ cấp lên màng lai đã phong bế, ủ với kháng thể thứ cấp trước đó và thực hiện việc xác định. Điều này sẽ chỉ ra khả năng kháng thể thứ cấp xác định được kháng thể sơ cấp. Nếu đây không phải là vấn đề, có thể pha loãng kháng nguyên đã tinh sạch hoặc lysate theo cấp độ khác nhau (serially diluted), chấm lên màng, thực hiện quá trình ủ và xác định kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp. Điều này sẽ chỉ ra khả năng kháng thể sơ cấp xác định được đích. Nếu đây vẫn không phải là vấn đề, phải kiểm tra việc chuyển lên màng lai. Phân tử có MW xác định có màu không phải lúc nào cũng chỉ thị đúng hiệu quả chuyển lên màng lai của protein đích. Sử dụng chất nhuộm thuận nghịch (reversible stain) như Ponceau S (Salinovich và Montelaro, 1986) là cách tốt nhất để kiểm tra hiệu quả chuyển của protein đích.

Cùng với sự phát triển nhanh chóng các phương pháp xác định có độ nhạy cao, ảnh hưởng nền cũng trở thành vấn đề phổ biến nhất mà chúng ta gặp phải khi thực hiện Western blot. Để giải quyết vấn đề nền hãy dừng thí nghiệm và kiểm tra lại cẩn thận màng lai. Ảnh hưởng nền có hiện trên toàn màng lai (trên cả giếng và khu vực giữa các giếng), hay chỉ giới hạn trong giếng (trên các băng thêm, hoặc cả giếng ở một số trường hợp đều biểu hiện)? (Is the background occurring all over the blot ( i.e., over the lanes and the areas between the lanes), or is it confined to the lanes themselves (i.e.,extra bands,or in some cases,the entire lane showing up)?

Vì western blot để nguyên mà không dịch ra tiếng Việt, vì vậy blot cứ để nguyên là blot ok?
lysate: dịch chiết
conjugate: cộng hợp
serially diluted: chuỗi pha loãng

Is the background occurring all over the blot ( i.e., over the lanes and the areas between the lanes), or is it confined to the lanes themselves (i.e.,extra bands,or in some cases,the entire lane showing up)

Hiện tượng nền xảy ra trên toàn bộ blot (tức ở cả đường chạy và vùng giữa các đường chạy), hay chỉ trên đường chạy (tức xuất hiện nhiều băng phụ hoặc trong một số trường hợp là một dải dọc theo đường chạy)
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Avidin và Streptavidin<o:p></o:p>
Cũng có thể thực hiện ý tưởng tương tự bằng nhóm chỉ thị đặc biệt: thí dụ enzyme phức (multimeric complexes of enzyme Protein complex:dạng protein/enzyme có cấu trúc gồm nhiều loại protein khác nhau, là một cấu trúc của protein có cấu trúc bậc 4 như Hemoglobin) có cung cấp trên thị trường. Ý tưởng ban đầu là làm thế nào để một phân tử kháng thể sơ cấp liên kết với càng nhiều nhóm chỉ thị càng tốt. <o:p></o:p>
multimeric complexes of enzyme: phức hệ đa enzyme
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Thường chỉ thực hiện tinh sạch khi cần chắc chắn đặc hiệu loài. Hấp thụ chéo (cross-adsorption) đề cập trong phần trên là phương pháp trái ngược với tinh sạch ái lực. Hơn nữa, không có chất phản ứng thứ cấp hấp thụ chéo nào đặc hiệu loài hoàn toàn: có tương đồng giữa các loài nên kháng thể hấp thụ chéo sẽ giữ Ig ngoại lai nếu có thể (Furthermore no cross-adsorbed secondary reagent is completely species specific: there is enough homology between species that even a cross-adsorbed antibody will pick up a “foreign” Ig if enough of it is present). Hoàn toàn không thể thu chất phản ứng thứ cấp 100% đặc hiệu loài, lớp, hay isotype, bởi vì luôn có sự tương đồng giữa cái cần và không cần ở cấp độ nào đó.
Chú ý:

adsorb = hấp phụ
absorb = hấp thụ
Hai cái này khác nhau ở đâu thì đọc lại hoá lý, hoá công.

Furthermore no cross-adsorbed secondary reagent is completely species specific: there is enough homology between species that even a cross-adsorbed antibody will pick up a “foreign” Ig if enough of it is present

Hơn nữa không có chất hấp phụ
chéo bậc hai nào hoàn toàn đặc hiệu loài. Độ tương đồng giữa các loài đủ để kháng thể hấp phụ chéo bắt giữ Ig "ngoại loài" khi có mặt với lượng lớn.
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Báo cáo Hết chương 13. Bác Hưng sửa giúp em đi bác để em còn tổng kết chương này(y)
Ai lại đòi nợ thế bao giờ không. Độ này bận quá không đọc hết (hình như độ trước cũng thế :D) nên chỉ đọc các phần chữ đậm thôi nhé.
 

happyfly

Member
Ai lại đòi nợ thế bao giờ không. Độ này bận quá không đọc hết (hình như độ trước cũng thế :D) nên chỉ đọc các phần chữ đậm thôi nhé.
Em được rèn luyện trong môi trường khắc nghiệt nên giờ mặt dày lắm. Không ỉ eo bao giờ bác mới sửa cho em :oops:.

Em sửa rồi gửi cho bác sau. Các hấp phụ và hấp thụ em có biết nhưng dạo này đầu óc hơi mụ mị. Cái từ chuỗi pha loãng cũng sửa một lần rồi.

Cảm ơn 1 cái đại diện thôi nha bác, he he.
 

Similar threads

Facebook

Top