Dịch cuốn MOLECULAR BIOLOGY PROBLEM SOLVER

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Could the crushed glass from your purification kit be leaking out with your final product?

Cùng với việc sử dụng máy tính để thu kết quả, đây là cách thuận tiện để xây dựng những mô tả về mẫu (sample profiles) để dễ tìm kiếm và thay thế (overlays).<o:p></o:p>
<o:p></o:p>

Mảnh vỡ từ kit tinh sạch có
nằm cùng sản phẩm cuối cùng hay không?

sample profile: hồ sơ mẫu

overlay: A transparent sheet containing graphic matter, such as labels or colored areas, placed on illustrative matter to be incorporated into it.

Hic chưa tìm ra từ nào hay. Hay dịch là "đối chiếu" nhỉ. Overlay ở đây ý là khi dùng máy tính thì có thể tích hợp các đường cong kết quả trên 1 đồ thị để dễ đối chiếu, so sánh.
<o:p> </o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Mẫu siêu loãng phân tích tốt hơn khi sử dụng giếng có đường truyền sáng dài hoặc bộ điều khiển độ dài sóng cố định đặc hiệu cao (fixed wavelength monitor of high specification).
Bộ điều khiển bước sóng cố định có đặc tính kỹ thuật cao
<o:p> </o:p>
Sự thay đổi đột ngột (sharp changes- đột ngột, sắc nét…?) ở lân cận của 280nm (Hình 4.13) làm tăng độ sai lệch của độ hấp thụ (amplify any absorbance inaccuracy).
<o:p> </o:p>
sharp changes: biến thiên mạnh
amplify any absorbance inaccuracy: làm khuếch đại bất kỳ sai số nào trong độ hấp thụ

Xác định ảnh hưởng dư trên phổ bằng cách đổi tỉ lệ hấp thụ liên quan (relevant absorbance ratio) (A11/A12) như trong hình 4.14.<o:p></o:p>
Có thể xác định tác động khác đối với phổ khi tương quan tỷ lệ hấp thụ (A11/A12) thay đổi như trong hình 4.14

Hic nhìn cái hình khó hiểu thấy mồ.
<o:p> </o:p>
Khi đường đồ thị thẳng (in straight line conditions), có thể xác định nồng độ chưa biết của mẫu từ giá trị hấp thụ của nó và giá trị hấp thụ của nồng độ nucleic acid và protein đã biết (hoặc một yếu tố căn chỉnh tương ứng khác-an appropriate calibration factor).<o:p></o:p><o:p></o:p>
Under straight line conditions: dưới những điều kiện tuyến tính
or an appropriate conversion calibration factor: hoặc chất chuẩn thích hợp
<o:p> </o:p>
Khi đường biểu thị độ hấp thụ và nồng độ theo quy luật Beer-Lambert không thẳng, không thể đo chính xác DNA và protein mà chỉ sử dụng một yếu tố (như độ hấp thụ phân tử - molar extinction coefficient or molar absorptivity http://en.wikipedia.org/wiki/Molar_absorptivity)
molar extinction coefficient: hằng số tắt :eek:
<o:p> </o:p>

Điều này không ảnh hưởng tới quá trình định lượng bởi có thể căn chỉnh phép đo bằng hệ dung dịch chuẩn (bracketing standard solutions) hay đường chuẩn.<o:p></o:p><o:p></o:p><o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
bracketing standard solutions= working standard solutions = dung dịch chuẩn abc (chưa nghĩ ra abc là cái gì)
Ý là các dung dịch với 1 chuỗi loãng nhất định dùng để lập đường chuẩn trước khi đo với mẫu

<o:p></o:p> DNA từ mạch kép sang mạch đơn làm tăng độ hấp thụ (độ đậm quang học - hyperchromicity) làm thay đổi cường độ hấp thụ tại 260nm. <o:p></o:p><o:p></o:p>
hyperchromicity: tăng sắc tính:eek:
<o:p> </o:p>
<o:p></o:p> Việc tính toán nồng độ protein và peptide cũng cần đường tuyến tính của đáp ứng và áp dụng những nguyên tắc tương tự trong các phép đo chúng (Calculations of protein and peptide concentration also require linearity of response and the same principles apply to their measurements).<o:p></o:p>
Đèn deuterium có thể tạo ra đáp ứng tuyến tính lên tới ba đơn vị của độ hấp thụ đáp ứng tuyến tính này của các đèn xenon giảm gần hai đơn vị hấp thụ (Deuterium lamps can generate linear responses up to three units of absorbance;the linear response of xenon lamps decreases at approximately two units of absorbance.).<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Việc tính toán và đo đạc nồng độ protein và peptide cũng đòi hỏi đáp ứng có tính chất tuyến tính.
Đèn deuterium có thể tạo ra đáp ứng tuyến tính trong khoảng dưới ba đơn vị hấp thụ; đáp ứng tuyến tính của đèn xenon bắt đầu giảm khi độ hấp thụ đạt xấp xỉ 2 đơn vị

 

happyfly

Member
Tỉ lệ A260: A280 có thể tin cậy được không khi dùng để đánh giá nhiễm potein trong quá trình chuẩn bị nucleic acid?<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Mục đích chính của việc dùng tỉ lệ A260: A280 là xác định nhiễm nucleic acid trong quá trình chuẩn bị protein (Warburg và Christian, 1942), không phải ngược lại. Tỉ lệ này có thể mô tả chính xác độ tinh sạch nucleic acid nhưng cũng có thể gây sai lầm. Độ hấp thụ phân tử của DNA lớn có thể làm che đi sự có mặt của protein (Glasel, 1995), và có nhiều hóa chất sử dụng trong quá trình tinh sạch DNA hấp thụ tại 260nm (Huberman, 1995). Manchester (1995), Wilfinger, Mackey, và Chomczynski (1997) đã đưa ra ảnh hưởng nghiêm trọng của muối và pH lên độ hấp thụ tại 260 và 280nm trong quá trình chuẩn bị DNA và RNA.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Nếu bạn nghi ngờ về giá trị A260:A280, hãy kiểm tra nhiễm bằng cách kiểm tra độ hấp thụ trong khoảng 200-240nm, trong dải sóng này nucleic acid hấp thụ yếu nếu có (a region where nucleic acids absorb weakly if at all http://www.chinese-forums.com/showthread.php?p=83970), như mô tả trong phần trên. Như được trình bày trong Chương 1, “Lập kế hoạch để thành công trong phòng thí nghiệm”, nhiễm sẽ là vấn đề chỉ khi nó ảnh hưởng tới ứng dụng của bạn. Nếu bạn cần loại nhiễm nhưng không thực hiện được, Schy và Plewa (1989) có đưa ra phương pháp để đánh giá nồng độ và chất lượng của quá trình chuẩn bị DNA mà có nhiễm bằng cách kiểm tra cả huỳnh quang diaminobenzoic acid và độ hấp thụ UV.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Làm thế nào để giảm thiểu các cuộc gọi trợ giúp?<o:p></o:p>
Tôn trọng ý kiến của nhà sản xuất về quy định nhiệt độ và độ ẩm hoạt động, và tránh bụi. Nên tránh và lau sạch dịch tràn ngay lập tức do một số vật liệu không chỉ ăn mòn tới các bộ phận của thiết bị mà còn để lại những cặn và hơi hấp thụ UV.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Tuổi thọ lớn nhấtbóng có thể đạt được?<o:p></o:p>
Bóng deuterium<o:p></o:p>
Những thiết kế cũ trước kia đòi hỏi phải khởi động và giữ nguồn điện bóng deuterium trước khi đo mẫu. Chỉ thị tốt nhất là thời gian sử dụng của bóng UV. Khi bóng UV đạt tới tuổi thọ nhà sản xuất đưa ra, ánh sáng mờ dần và gây ra giá trị dao động, không lặp lại. Bóng deuterium cũng mất dần hiệu quả nếu cất đi không dùng. Thời gian cất giữ không nên quá một năm.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Bạn có thể nên thay ngay bóng deuterium khi chúng đạt tới tuổi thọ dự đoán?
Câu trả lời là không. Bóng deuterium vẫn có thể tạo ra kết quả chính xác và có thể lặp lại khi đã quá tuổi thọ dự đoán. Đơn giản là kiểm tra độ chính xác của bóng cũ với mẫu kiểm chứng. Các bóng deuterium công nghệ mạch thiết kế gần đây chỉ bật lên đo mẫu (lúc cần đóng mạch) có tuổi thọ trên 5 năm.<o:p></o:p>
Việc đóng, ngắt mạch thường xuyên sẽ làm giảm tuổi thọ bóng deuterium, nhưng không phải đối với bóng deuterium công nghệ mạch như đã nói trong phần trên, loại này có thể tồn tại sau hàng ngàn lần đóng/ngắt.<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Vonfram
Bóng Vonfram thường có tuổi thọ cao hơn – ít nhất là 6 tháng nếu dùng liên tục và nhiều năm nếu chỉ trong thời gian làm việc thông thường. Trong thời gian dài sử dụng, thiết bị có xu hướng dao động do bị nâng nhiệt, trong khi đó lại giảm độ nhiễu nền . Tốt hơn là để thiết bị ở chế độ hoạt động trong suốt thời gian làm việc và chuẩn lại nếu cần đo với độ nhiễu thấp hơn. Việc đóng ngắt thường xuyên có thể giảm tuổi thọ bóng trừ khi mạch điều khiển được thiết kế mà có giảm thiểu việc đóng ngắt của bóng.<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /><o:p></o:p>

Xenon
Các bóng xenon chỉ sáng khi đọc mẫu , tuổi thọ là 1000 tới 2000 giờ hoặc hơn theo thực tế sử dụng . Việc đóng ngắt thường xuyên không ảnh hưởng tới tuổi thọ của bóng.<o:p></o:p>

Khi cháy bóng deuterium trên thiết bị UV-nhìn thấy, bạn có thể thực hiện phép đo trong phổ nhìn thấy hay không?
Với phần mềm căn chỉnh kèm theo hiện nay, các thiết bị có thể vẫn tự căn chỉnh và hoạt động trong phổ nhìn thấy mà không cần bóng deuterium. Nguồn vonfram có thể tạo ra phổ từ 320 tới 1100nm, có trùng với UV một dải sóng thấp nhất của phổ. Tương tự như vậy, thiết có bóng Vonfram không còn hoạt động được cũng vẫn tạo ra tín hiệu hấp thụ UV chính xác.

Đâu là đường hướng để xác định hằng số tắt của một hợp chất?

Quy luật Beer-Lambert đưa ra độ hấp thụ A bằng tích của độ hấp thụ phân tử (hay hằng số tắt extinction coefficient E), độ dài đường truyền sáng L và nồng độ C. Hằng số tắt đưa ra giá trị hấp thụ của dung dịch của một hợp chất, và đặc điểm của hợp chất đó
A=ECL
Có thể xác định hằng số tắt theo kinh nghiệm từ việc đo độ hấp thụ trên nồng độ đã biết của hợp chất, như trình bày trong Chương 10. Một số hằng số tắt của nucleotide được đưa ra trong Bảng 10.2, Chương 10. Có thể tìm thấy dữ hiệu của riêng sản phẩm trong tờ rơi nhà sản xuất cung cấp. Các vấn đề về hấp thụ quan trọng trong định lượng nucleotides, oligonucleotide, và polynucleotide sẽ được trình bày chi tiết hơn trong Chương 10.<o:p></o:p>


Thế nào là hằng số tắt của Oligonucleotide?
Một đường hướng phổ biến là áp dụng hệ số quy đổi (conversion factor) 33 hoặc 37mg trên A260 cho oligonucleotides và DNA mạch đơn, theo thứ tự, và điều này là đủ cho hầu hết các ứng dụng. Tham khảo Chương 10 để có chi tiết hơn về việc lựa chọn oligonucleotide và những hạn chế.
<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
[FONT=&quot]Khi [/FONT][FONT=&quot]chuyển tín h[/FONT][FONT=&quot]iệu [/FONT][FONT=&quot]hấp thụ protein sang nồng độ [/FONT][FONT=&quot]c[/FONT][FONT=&quot]ó [/FONT][FONT=&quot]hệ số quy đổi hay [/FONT][FONT=&quot]không?<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]Do thành phần amino acid không đồng nhất và ảnh hưởng khác nhau của các amino acid lên độ hấp thụ nên không có hệ số quy đổi cho tất cả các protein. Việc đo độ hấp thụ protein tại 280nm phụ thuộc vào thành phần [/FONT][FONT=&quot]tyrosine, [/FONT][FONT=&quot]phenylalanine,[/FONT][FONT=&quot] và [/FONT][FONT=&quot]tryptophan trong protein [/FONT][FONT=&quot]và không sử dụng bước sóng này nếu không có những amino acid trên. Sau đó có thể xác định protein bằng liên kết peptide trong vùng 210nm. [/FONT][FONT=&quot]Christian-Warburg[/FONT][FONT=&quot] cung cấp đường hướng để chuyển độ hấp thụ protein sang nồng độ nhưng cần dựa trên thành phần của protein [/FONT][FONT=&quot](Manchester,1996;[/FONT][FONT=&quot]Harlow [/FONT][FONT=&quot]và[/FONT][FONT=&quot] Lane,1988).[/FONT][FONT=&quot]<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]Có n[/FONT][FONT=&quot]hiều phương pháp[/FONT][FONT=&quot] đưa ra [/FONT][FONT=&quot]trong tài liệu để[/FONT][FONT=&quot] xác định [/FONT][FONT=&quot]hằng[/FONT][FONT=&quot] số tắt một cách [/FONT][FONT=&quot]chính xác (thí dụ, Mach,[/FONT][FONT=&quot]Middaugh,[/FONT][FONT=&quot] và[/FONT][FONT=&quot] Lewis,1992). [/FONT][FONT=&quot]Khi [/FONT][FONT=&quot]đã biết[/FONT][FONT=&quot]thành phần amino acid, có thể sử dụng[/FONT][FONT=&quot]phương trình để xác định E, [/FONT][FONT=&quot]trong đó có [/FONT][FONT=&quot]tính đến lượng tyrosine và tryptophan[/FONT][FONT=&quot] và [/FONT][FONT=&quot]liên kết disulfide (nếu biết)[/FONT][FONT=&quot], liên kết này đóng vai trò ít [/FONT][FONT=&quot]quan trọng hơn. Đôi khi [/FONT][FONT=&quot]bắt buộc phải thiết lập [/FONT][FONT=&quot]phép đo dưới điều kiện biến tính (thí dụ, 6M Guanidine-HCl) để[/FONT][FONT=&quot] đánh giá chính xác khi không còn [/FONT][FONT=&quot]protei[/FONT][FONT=&quot]n[/FONT][FONT=&quot], đặc[/FONT][FONT=&quot] biệt [/FONT][FONT=&quot]khi [/FONT][FONT=&quot]có lượng lớn vòng[/FONT][FONT=&quot] thơm ở sâu trong lõi protein. [/FONT][FONT=&quot]Có thể xác định đ[/FONT][FONT=&quot]iều[/FONT][FONT=&quot] này[/FONT][FONT=&quot]bằng cách [/FONT][FONT=&quot]so sánh phổ[/FONT][FONT=&quot] của[/FONT][FONT=&quot] dẫn xuất [/FONT][FONT=&quot]sơ cấp [/FONT][FONT=&quot]và thứ cấp[/FONT][FONT=&quot] ([/FONT][FONT=&quot]normal or second derivative[/FONT][FONT=&quot])[/FONT][FONT=&quot]khi có hay không có mặt [/FONT][FONT=&quot]tác nhân biến tính.<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]Ưu điểm và nhược điểm của các thí nghiệm định lượng protein là gì?<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]Có bốn thí nghiệm chính[/FONT][FONT=&quot]dựa trên chất phản ứng [/FONT][FONT=&quot]để phân tích[/FONT][FONT=&quot] protein:[/FONT][FONT=&quot]<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]1. [/FONT][FONT=&quot]Bradford (Coomassie Blue) [/FONT][FONT=&quot]có[/FONT][FONT=&quot] phổ phản ứng rộng nhất và độ[/FONT][FONT=&quot]nhạy[/FONT][FONT=&quot] cao[/FONT][FONT=&quot] nhất. Hạn chế [/FONT][FONT=&quot]của phương pháp là[/FONT][FONT=&quot] đáp ứng có thể biến đổi [/FONT][FONT=&quot]theo loại [/FONT][FONT=&quot]protein do[/FONT][FONT=&quot]liên kết giữa [/FONT][FONT=&quot]các [/FONT][FONT=&quot]protein và chất nhuộm[/FONT][FONT=&quot] là [/FONT][FONT=&quot]khác nhau . Bước sóng tối ưu [/FONT][FONT=&quot]khi [/FONT][FONT=&quot]đo độ[/FONT][FONT=&quot] hấp thụ [/FONT][FONT=&quot]là 595nm. [/FONT][FONT=&quot]Có thể cải tiến đ[/FONT][FONT=&quot]ộ nhạy khoảng 15% [/FONT][FONT=&quot]khi thời gian phản ứng dưới[/FONT][FONT=&quot] 30 phút, và [/FONT][FONT=&quot]có thể kết hợp [/FONT][FONT=&quot]các đáp ứng [/FONT][FONT=&quot]nếu [/FONT][FONT=&quot]thời gian [/FONT][FONT=&quot]phản ứng [/FONT][FONT=&quot]dài[/FONT][FONT=&quot] hơn[/FONT][FONT=&quot]. [/FONT][FONT=&quot]Do c[/FONT][FONT=&quot]ác chất tẩy [/FONT][FONT=&quot]có [/FONT][FONT=&quot]đáp ứng nền cao [/FONT][FONT=&quot]nên cần [/FONT][FONT=&quot]phân tích [/FONT][FONT=&quot]mẫu trống.<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]2. BCA, đo tại 562nm, có độ nhạy[/FONT][FONT=&quot] bằng[/FONT][FONT=&quot] khoảng một nửa phương pháp Bradford nhưng[/FONT][FONT=&quot] lại[/FONT][FONT=&quot] có điểm[/FONT][FONT=&quot] mút[/FONT][FONT=&quot] ổn định[/FONT][FONT=&quot] ([/FONT][FONT=&quot]stable endpoint[/FONT][FONT=&quot])[/FONT][FONT=&quot] hơn phương pháp Lowry. [/FONT][FONT=&quot]Phương pháp này[/FONT][FONT=&quot] cũng đư[/FONT][FONT=&quot]a ra[/FONT][FONT=&quot] đáp ứng đồng bộ hơn [/FONT][FONT=&quot]khi xác định [/FONT][FONT=&quot]các protein khác nhau[/FONT][FONT=&quot] nhưng lại có thể bị ảnh [/FONT][FONT=&quot]hưởng bởi c[/FONT][FONT=&quot]hất tẩy[/FONT][FONT=&quot] và [/FONT][FONT=&quot]không phù hợp với [/FONT][FONT=&quot]chất có tính [/FONT][FONT=&quot]khử.[/FONT][FONT=&quot]<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]3. Lowry, đo tại 750nm, [/FONT][FONT=&quot]gần [/FONT][FONT=&quot]nhạy [/FONT][FONT=&quot]bằng[/FONT][FONT=&quot]phương pháp [/FONT][FONT=&quot]Bradford, nhưng [/FONT][FONT=&quot]có thể bị ảnh hưởng bởi [/FONT][FONT=&quot]muối đệm amine hơn [/FONT][FONT=&quot]so với [/FONT][FONT=&quot]các phương pháp khác.[/FONT][FONT=&quot]<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]4. Biuret, đo tại 546nm, về cơ bản là tương tự như Lowry[/FONT][FONT=&quot] nhưng phải có giai đoạn [/FONT][FONT=&quot]ủ[/FONT][FONT=&quot] ([/FONT][FONT=&quot]but involving a single incubation[/FONT][FONT=&quot])[/FONT][FONT=&quot] trong 20 phút. [/FONT][FONT=&quot]Trong[/FONT][FONT=&quot]môi trường [/FONT][FONT=&quot]kiềm các chất [/FONT][FONT=&quot]có[/FONT][FONT=&quot] nhiều hơn[/FONT][FONT=&quot] hai[/FONT][FONT=&quot] liên kết peptide [/FONT][FONT=&quot]sẽ tạo [/FONT][FONT=&quot]phức tím với sulphate đồng khi có mặt sodium potassium tartrate và potassium iodide[/FONT][FONT=&quot] (natri, kali tartrate và kali iot) [/FONT][FONT=&quot]trong chất phản ứng.[/FONT][FONT=&quot] Phương pháp này ít bị gây ảnh hưởng ngoại trừ muối amoni và có ít sai số [/FONT][FONT=&quot]hơn [/FONT][FONT=&quot]khi so sánh với[/FONT][FONT=&quot] phương pháp Lowry hay hấp thụ tia tử ngoại. Tuy nhiên, [/FONT][FONT=&quot]phương pháp này[/FONT][FONT=&quot] cần nhiều [/FONT][FONT=&quot]nguyên [/FONT][FONT=&quot]liệu hơn. Nhìn chung, đâ[/FONT][FONT=&quot]y [/FONT][FONT=&quot]là một [/FONT][FONT=&quot]phương pháp [/FONT][FONT=&quot]tốt, mặc dù không nhanh và nhạy như Bradford.[/FONT][FONT=&quot]<o:p></o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]<o:p> </o:p>[/FONT]
[FONT=&quot]Smith (1987) đư[/FONT][FONT=&quot]a ra [/FONT][FONT=&quot]các hợp chất [/FONT][FONT=&quot]có thể ảnh hưởng tới các phương pháp trên [/FONT][FONT=&quot]và[/FONT][FONT=&quot] những[/FONT][FONT=&quot] vấn đề có thể [/FONT][FONT=&quot]thấy được khi [/FONT][FONT=&quot]sử dụng chuẩn [/FONT][FONT=&quot]là [/FONT][FONT=&quot]BSA([/FONT][FONT=&quot]xem trong[/FONT][FONT=&quot] Harlow [/FONT][FONT=&quot]và [/FONT][FONT=&quot]Lane,1988;[/FONT][FONT=&quot]Peterson,1979).<o:p></o:p>[/FONT]
<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Chương 4 tạm xong và đã chuyển cho bác Hưng. Chương này có nhiều phần liên quan tới Hóa (về pH kế) mình dịch ko ổn lắm . Bạn nào rảnh thì nhận lời xem giúp cái :please:
 

happyfly

Member
Western Blotting<o:p></o:p>
Peter Riis<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
TÍNH CHẤT VẬT LÍ CỦA PROTEINS<o:p></o:p>
Bạn biết gì về protein của bạn?<o:p></o:p>
Hiện nay có rất nhiều phương pháp được cung cấp để truyền và xác định protein, nên để lựa chọn đúng bạn phải có ý tưởng càng rõ ràng càng tốt theo yêu cầu cụ thể của mình. Lựa chọn này phần lớn sẽ phụ thuộc vào bản chất của protein đích. Hiểu biết của bạn dù có hạn cũng vẫn là một lợi thế.<o:p></o:p>
Protein của bạn có nhiều như thế nào? Không cần thiết phải trả lời câu hỏi này một cách chính xác: chỉ cần dự đoán tương đối. Mẫu của bạn có dễ thu được và nhiều không, hay hạn chế và rất quý? Protein đích có nhiều trong mẫu (như trong trường hợp protein biển hiện quá mức - over expression) hay rất ít (như cytokine)? Nồng độ protein rất nhỏ hay lượng mẫu rất hạn chế sẽ đòi hỏi phương pháp xác định có độ nhạy cao hơn.<o:p></o:p>
Khối lượng phân tử (molecular weight-MW) của protein đích là bao nhiêu? Protein có MW nhỏ (nhỏ hoặc bằng 12kDa) khó giữ hơn so với protein có MW lớn hơn. Người ta đề nghị sử dụng màng có kích thước lỗ 0.1 hoặc 0.2 micron để truyền protein MW nhỏ, và PVDF có xu hướng giữ lại protein có MW nhỏ hơn so với nitrocellulose. Giới hạn nhỏ nhất của protein cho việc truyền là gần 5kDa, mặc dù điều này còn phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện của phân tử protein.<o:p></o:p>
Có thể cải thiện sự truyền phân tử protein có MW lớn (lớn hơn 100kDa) bằng cách bổ sung tới 0.1% SDS vào dung dịch đệm truyền (Lissilour và Godinot, 1990). Cũng có thể tăng thời gian truyền để tăng hiệu quả đối với các protein có MW lớn.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Cần phải chú ý những đặc tính nào khác về protein bạn đang làm?<o:p></o:p>
Trong trường hợp protein khá kiềm (có pI cao hơn pH dung dịch đệm truyền), protein đó sẽ không được vận chuyển tới anode (anốt) do việc truyền này takes place on the basis of charge. Trong những trường hợp này, tốt nhất là sử dụng SDS trong dung dịch đệm truyền. Cách khác là thực hiện sự truyền kẹp (transfer sandwich) cho màng trên cả hai mặt của bản gel.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
LỰA CHỌN CHIẾN LƯỢC XÁC ĐỊNH: <o:p></o:p>
TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG XÁC ĐỊNH<o:p></o:p>
Hệ thống xác định được tính từ thiết bị đo màu đơn giản nhất đặt trên bàn thí nghiệm cho tới hệ thống bao gồm nhiều thiết bị phức tạp (Bảng 13.1). Đơn giản nhất là xác định phóng xạ: chất phản ứng thứ cấp được gắn với đồng vị phóng xạ, thường sử dụng iot 125 phát tia gamma năng lượng thấp (gamma-emitter iodine-125). Sau khi ủ kháng thể sơ cấp trên blot, đưa chất phản ứng thứ cấp đã gắn đồng vị phóng xạ (thường là protein A, nhưng cũng có thể là kháng thể thứ cấp) vào, rửa blot và hiện film sau vài giờ hoặc một ngày. Có thể xác định blot phóng xạ nhanh hơn nếu sử dụng bản phosphor lưu trữ thay cho film. Những thảo luận chi tiết về đặc tính và lợi ích của việc xác định bằng film và máy quét sẽ được trình bày trong Chương 14, Lai Nucleic Acid.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Protein đích có nhiều trong mẫu (như trong trường hợp protein biển hiện quá mức - over expression) hay rất ít (như cytokine)? Nồng độ protein rất nhỏ hay lượng mẫu rất hạn chế sẽ đòi hỏi phương pháp xác định có độ nhạy cao hơn.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Cần phải chú ý những đặc tính nào khác về protein bạn đang làm?<o:p></o:p>
Trong trường hợp protein khá kiềm (có pI cao hơn pH dung dịch đệm truyền), protein đó sẽ không được vận chuyển tới anode (anốt) do việc truyền này takes place on the basis of charge. Trong những trường hợp này, tốt nhất là sử dụng SDS trong dung dịch đệm truyền. Cách khác là thực hiện sự truyền kẹp (transfer sandwich) cho màng trên cả hai mặt của bản gel.<o:p></o:p><o:p></o:p><o:p></o:p>
over expression: siêu biểu hiện
transfer: chuyển (ý là chuyển protein từ gel điện di lên màng)
transfer buffer: đệm chuyển
since transfer takes place on the basis of charge: do dịch chuyển của protein xảy ra trên cơ sở điện tích
transfer sandwich: chuyển kép


 

happyfly

Member
Phản ứng enzyme dùng rộng rãi trong nhiều hệ thống khác nhau để chỉ ra sự có mặt của kháng thể liên kết. Đơn giản nhất của xác định dựa vào enzyme là sự tạo màu. Trong trường hợp này, chất phản ứng thứ cấp kết hợp với enzyme, là horseradish peroxidase (HRP) hoặc alkaline phosphatase (APOPLAST). Sau khi ủ blot với chất phản ứng thứ cấp và rửa, ủ tiếp với cơ chất. Enzyme xúc tác phản ứng làm cơ chất hiện màu và kết tủa ngay trên màng, làm băng có gắn kháng thể sơ cấp hiện màu. Trong khi không nhạy như các phương pháp khác, nhưng phương pháp so màu này nhanh và đơn giản, không đòi hỏi những thiết bị đặc biệt.
<o:p></o:p>
Phương pháp huỳnh quang hóa học kết hợp đặc điểm của hai phương pháp phóng xạ và tạo màu. Cũng gắn enzyme (thường là HRP hoặc có khi sử dụng AP), nhưng trong trường hợp này phản ứng tạo ra sản phẩm phát quang hơn thay vì hiện màu. Thu ánh sáng phát ra trên film X quang, tương tự như trong blot phóng xạ. Người ta cũng cung cấp thiết bị hình ảnh chuyên dụng cho blot huỳnh quang hóa học. Phương pháp này rất nhạy, và dễ tháo khuôn blot để dùng cho lần sử dụng tiếp theo (blots are easily stripped for subsequent reprobing subsequent reprobing).<o:p></o:p>
Có khác biệt lớn trong các hệ thống xác định huỳnh quang hóa học hiện có. Phổ biến nhất là hệ thống huỳnh quang HRP(luminol-based HRP). Hệ thống này phát ra tín hiệu khả dụng trong một tới hai tiếng. Những hệ thống HRP nhạy hơn và mới hơn có thể phát ánh sáng khả dụng trong hơn 24 tiếng; tuy nhiên, cơ chất sử dụng đắt hơn và cần tối ưu hóa hệ thống huỳnh quang cẩn thận hơn. Hệ thống này không sử dụng rộng rãi trong Western blott, nhưng được đánh giá là có độ nhạy cao và phát ra ánh sáng trong khoảng thời gian dài. Hệ thống phát ra tín hiệu ánh sáng trong thời gian dài này (extended light output) có ưu điểm là thu được nhiều hình ảnh (exposures) từ một blot.
<o:p></o:p>
Cùng với đáp ứng của thiết bị quét huỳnh quang, người ta đưa ra phương pháp xác định mới. Kháng thể thứ cấp có thể kết hợp ngay với phân tử phát huỳnh quang và việc xác định thực hiện trực tiếp. Mặc dù có tồn tại nhưng phương pháp này không đủ nhạy trong nhiều trường hợp. Lúc đó người ta sử dụng chất phản ứng thứ cấp-gắn enzyme (thường dùng AP) và cơ chất để có thể tạo ra sản phẩm phát quang không tan. Kết quả phản ứng enzyme đã khuếch đại tín hiệu, có độ nhạy cao hơn so với trường hợp chất phản ứng thứ cấp gắn huỳnh quang. Máy quét huỳnh quang sau đó sẽ đọc blot và ghi dưới dạng ảnh kĩ thuật số.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Phương pháp này rất nhạy, và dễ tháo khuôn blot để dùng cho lần sử dụng tiếp theo (blots are easily stripped for subsequent reprobing subsequent reprobing).<o:p></o:p>
Có khác biệt lớn trong các hệ thống xác định huỳnh quang hóa học hiện có. Phổ biến nhất là hệ thống huỳnh quang HRP(luminol-based HRP). Hệ thống này phát ra tín hiệu khả dụng trong một tới hai tiếng. Những hệ thống HRP nhạy hơn và mới hơn có thể phát ánh sáng khả dụng trong hơn 24 tiếng; tuy nhiên, cơ chất sử dụng đắt hơn và cần tối ưu hóa hệ thống huỳnh quang cẩn thận hơn. Hệ thống này không sử dụng rộng rãi trong Western blott, nhưng được đánh giá là có độ nhạy cao và phát ra ánh sáng trong khoảng thời gian dài. Hệ thống phát ra tín hiệu ánh sáng trong thời gian dài này (extended light output) có ưu điểm là thu được nhiều hình ảnh (exposures) từ một blot.
<o:p></o:p>
blot: màng:eek:
blots are easily stripped for subsequent reprobing: dễ dàng thôi kháng thể ra khỏi màng để sau đó nhuộm màng bằng kháng thể khác.

Ở đây ý nói là sau khi chuyển protein lên màng, nhuộm bằng kháng thể và xác định tín hiệu, thì có thể rửa (bằng stripping buffer) loại kháng thể bám trên màng (trong khi không tác động đến protein), sau đó dùng loại kháng thể khác để nhuộm màng này.

Hệ thống phát ra tín hiệu ánh sáng trong thời gian dài này (extended light output) có ưu điểm là thu được nhiều hình ảnh (exposures) từ một blot

Lần sau nên để cả câu tiếng Anh thì mình đỡ phải tra lại trong bản gốc.

Sửa lại thành: Ưu điểm của những hệ thống phát ra ánh sáng trong thời gian dài như vậy là có thể thu tín hiệu (exposure) một vài lần từ cùng một blot.

Ý ở đây là nếu dùng các loại enzyme phát quang rồi dùng film để thu tín hiệu quang này thì nếu thời gian phát quang dài thì có thể cho blot tiếp xúc với nhiều bản film để thu tín hiệu.
 

happyfly

Member
Tiêu chuẩn nào để lựa chọn phương pháp xác định?
<o:p></o:p>

Độ nhạy<o:p></o:p>
Xu hướng thông thường để chọn là phương pháp có độ nhạy cao nhất hiện có. Người ta luôn muốn có hệ thống có độ nhạy cao để xác định được lượng nhỏ protein ( low-abundance proteins), hay với trường hợp mà kháng thể sơ cấp đắt hoặc hạn chế trong cung cấp, bởi hệ thống này cho phép sử dụng kháng thể đã pha loãng nhiều( high dilutions). Mặt khác, hệ thống có độ nhạy thấp, đặc biệt là hệ thống tạo màu, khá đơn giản trong quá trình thực hiện, ít đòi hỏi sự chính xác trong tối ưu hóa và ít có vấn đề về nền. Tăng quá mức độ nhạy có thể gây ra nhiều vấn đề hơn lợi ích nó có thể mang lại.
<o:p></o:p>
Bạn có thể kết luận gì từ dữ liệu độ nhạy thương mại? Thật khó để so sánh các độ nhạy cung cấp thương mại. Mặc dù những giá trị độ nhạy được xây dựng đúng cách nhưng khó so sánh giữa các hệ thống khác nhau bởi những giá trị này phụ thuộc vào điều kiện xác định tương ứng. Kháng thể sơ cấp ảnh hưởng lớn tới độ nhạy tổng của bất kỳ hệ thống nào, do đó việc so sánh giữa các hệ thống sử dụng kháng thể sơ cấp khác nhau không có ý nghĩa như chúng ta nghĩ lúc đầu.
<o:p></o:p>
So sánh hai hệ thống xác định khác nhau cần sử dụng cùng loại protein đích, kháng thể sơ cấp, và chất phản ứng thứ cấp nếu có thể. Rất khó đạt tới so sánh như thế này. Độ nhạy thông báo cũng thường thực hiện với protein tinh khiết hơn là lysate thô. Do đó, nên coi độ nhạy thông báo là một giá trị xấp xỉ và đừng mong (mơ tưởng :nhannho:) rằng hệ thống của bạn sẽ đạt được mức nhạy tương đương như công bố của nhà sản xuất.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Người ta luôn muốn có hệ thống có độ nhạy cao để xác định được lượng nhỏ protein ( low-abundance proteins), hay với trường hợp mà kháng thể sơ cấp đắt hoặc hạn chế trong cung cấp, bởi hệ thống này cho phép sử dụng kháng thể đã pha loãng nhiều( high dilutions). <o:p></o:p>
low-abundance proteins: protein có hàm lượng thấp, protein ít phổ biến
high dilution: độ pha loãng cao, nồng độ thấp
 

happyfly

Member
Khoảng thời gian của tín hiệu (Signal Duration)<o:p></o:p>
Liệu trường hợp bạn đang nghiên cứu có đòi hỏi phải kéo dài thời gian phát tín hiệu để thu hình ảnh nhiều lần một blot ban đầu?

<o:p></o:p>
Khả năng Định lượng<o:p></o:p>
Hệ thống dựa trên phim (huỳnh quang hóa học và phóng xạ) cũng như phương pháp quét huỳnh quang đều cho phép định lượng protein đích. Trong khi kết quả trên phim phân tích bằng máy đo mật độ thì dữ liệu kỹ thuật số thô đã được định lượng ngay khi thu nhận từ máy quét huỳnh quang (và máy quét phosphor lưu trữ trong phương pháp phóng xạ). Hệ thống dựa trên phim có dãy thẳng (bị giới hạn do đáp ứng của film) có tốt hơn so với một cấp khuếch đại, trong khi nhà sản xuất máy quét huỳnh quang công bố về cái gì đó kiểu như hai cấp khuyếch đại (The linear range of film-based systems (limited by the response of the film) is a little better than one order of magnitude, while the anufacturers of fluorescent scanners claim something closer to two orders of magnitude.)

<o:p></o:p>
Hãy lưu ý tới các khuyến cáo khi định lượng blot protein. Phải chạy thang chuẩn (được biết tới là chứa các lượng protein đích tinh khiết khác nhau - không nên nhầm với thang phân tử lượng chuẩn vẫn dùng làm thang đo khi điện di) trên tất cả blot, ngay cả kỹ thuật rất ổn định cũng có khác nhau giữa các blot. Nên tải thang chuẩn lên gel, điện di, và chuyển đúng y như cách bạn làm với mẫu.

<o:p></o:p>
Có thể định lượng trong giới hạn của phổ thang chuẩn trên blot: không chấp nhận giá trị ngoại suy (các giá trị thu được nằm ngoài phổ chuẩn). Điều này cùng với đường tuyến tính có nghĩa là phải chạy mẫu với nhiều độ pha loãng khác nhau trên cùng một blot. Với tất cả đường chuẩn và độ pha loãng mẫu được đưa ra, lượng dữ liệu định lượng thu được một blot có phần bị giới hạn (Given all the lanes of standards and sample dilutions, the amount of quantitative data that can be extracted from a single blot is somewhat limited.). Blot định lượng protein có thể hữu ích trong một số trường hợp, nhưng không thể thay thế cho kỹ thuật như ELISA hay RIA.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Hệ thống dựa trên phim có dãy thẳng (bị giới hạn do đáp ứng của film) có tốt hơn so với một cấp khuếch đại, trong khi nhà sản xuất máy quét huỳnh quang công bố về cái gì đó kiểu như hai cấp khuyếch đại (The linear range of film-based systems (limited by the response of the film) is a little better than one order of magnitude, while the anufacturers of fluorescent scanners claim something closer to two orders of magnitude.)

<o:p></o:p><o:p></o:p>Với tất cả đường chuẩn và độ pha loãng mẫu được đưa ra, lượng dữ liệu định lượng thu được một blot có phần bị giới hạn (Given all the lanes of standards and sample dilutions, the amount of quantitative data that can be extracted from a single blot is somewhat limited.). Blot định lượng protein có thể hữu ích trong một số trường hợp, nhưng không thể thay thế cho kỹ thuật như ELISA hay RIA.<o:p></o:p>
film-based system: hệ thống dùng phim
in order of smt: khoảng

The linear range of film-based systems (limited by the response of the film) is a little better than one order of magnitude, while the anufacturers of fluorescent scanners claim something closer to two orders of magnitude.)

Dải tuyến tính khi định lượng bằng hệ thống dùng phim (do đáp ứng của phim quyết định)
tốt hơn một chút trong một khoảng cường độ, trong khi nhà sản xuất máy quét huỳnh quang khẳng định về khả năng chính xác hơn trong hai khoảng cường độ.

Ý chỗ này là khả năng định lượng của hệ thống phim chỉ chính xác (tuyến tính) trong 1 khoảng nhất định, còn của hệ thống quét huỳnh quang thì trong hai khoảng. :eek:

is somewhat limited: theo mình nên bốc phét là "không thật sự chính xác"
 

happyfly

Member

in order of smt: khoảng

The linear range of film-based systems (limited by the response of the film) is a little better than one order of magnitude, while the anufacturers of fluorescent scanners claim something closer to two orders of magnitude.)

Dải tuyến tính khi định lượng bằng hệ thống dùng phim (do đáp ứng của phim quyết định)
tốt hơn một chút trong một khoảng cường độ, trong khi nhà sản xuất máy quét huỳnh quang khẳng định về khả năng chính xác hơn trong hai khoảng cường độ.

Ý chỗ này là khả năng định lượng của hệ thống phim chỉ chính xác (tuyến tính) trong 1 khoảng nhất định, còn của hệ thống quét huỳnh quang thì trong hai khoảng. :eek:

"
em chưa thống nhất được với bác Hưng về cái order of magnitude. tài liệu online có dịch là bậc khuếch đại () , độ lớn (trong từ điển). bác nào biết giải thích giúp cái nha :please:.
 

happyfly

Member
Yêu cầu về kháng thể<o:p></o:p>
Lựa chọn kháng thể sơ cấp thông thường không quá rộng như các yếu tố khác trong hệ thống xác định. Nguồn kháng thể sơ cấp có thể là do cung cấp thương mai, nơi lưu trữ phi lợi nhuận, và thậm chí từ những người nghiên cứu khác. Tìm kháng thể sơ cấp có thể mất nhiều thời gian, nhưng hãy tham khảo tài liệu như Linscott’ Directory (Linscott, 1999, và http://www.linscottsdirectory.com/index2.html), “Antibody Resource Page” (http://www.antibodyresource.com), Usenet newsgroup “Methods and Reagents” (bionet.molbio.methds-reagnts), và Stefan Dubel’s recombinant antibody page (www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/SDscFvSite.html) và www.antibody.com (Để nguyên bản gốc do nhu cầu tra cứu nếu cần thiết). <o:p></o:p>
Nếu không thấy kháng thể phù hợp với protein đích của bạn, chỉ có thể chọn trong hai cách là tự tạo kháng thể hay nhờ ai đó. Một số công ty như Berkeley Antibody Company, Genosys, <st1:City><st1:place>Rockland</st1:place></st1:City>, và Zymed (và nhiều công ty khác) có thể làm được việc này dựa trên yêu cầu trong hợp đồng. Cách nào bạn chọn cũng đều mất thời gian và khá tốn kém.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Khả năng rửa giải và tái nhuộm màng (tái dò bằng kháng thể khác - Reprobe) <o:p></o:p>
Khả năng tháo khuôn và tái dò<o:p></o:p>
Hệ thống phóng xạ và huỳnh quang hóa học rất phù hợp cho việc rửa giải và tái dò. Hệ thống khác (phát quang hóa học và tạo màu) có chất kết tủa không tan còn lại trên băng quan tâm mà chỉ có thể loại đi bằng dung môi, có nghĩa là phải thêm một bước không dễ chịu và có thể còn khó thực hiện trên blot. Không phải tất cả các protein đích đều qua được bước này (có phải ý câu này là không phải tất cả các protein đều còn nguyên vẹn sau khi xử lý bằng dung môi? Not all targets survive this treatment). (Những khuyến cáo quan trọng trong rửa giải sẽ được đưa ra trong phần dưới.)<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Yêu cầu về dụng cụ và thiết bị<o:p></o:p>
Chỉ sử dụng phóng xạ khi đã đáp ứng yêu cầu và được đào tạo đầy đủ và nghiêm ngặt về phóng xạ. Phương pháp phóng xạ, như phương pháp huỳnh quang hóa học, cũng đòi hỏi phòng tối (trừ khi có máy phosphor lưu trữ). Phương pháp huỳnh quang yêu cầu máy quét chuyên dụng. Phương pháp tạo màu không cần thiết bị hay dụng cụ chuyên dụng.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Không phải tất cả các protein đích đều qua được bước này (có phải ý câu này là không phải tất cả các protein đều còn nguyên vẹn sau khi xử lý bằng dung môi? Not all targets survive this treatment). <o:p></o:p>
Không phải tất cả các protein đích đều chịu được bước này.

Hiểu đúng rồi. Khác cái không phải xử lý bằng dung môi mà bằng stripping buffer
 

happyfly

Member
Yếu tố là quyết định để thu được kết quả có chất lượng cao?<o:p></o:p>
Cần cẩn thận lựa chọn nguyên liệu, hiểu các vấn đề đặt ra trong thí nghiệm để có hướng giải quyết, và biết rõ rằng phải tối ưu hệ thống mới để thu được kết quả tốt nhất. Bạn sẽ mất thời gian cho tối ưu hóa nhưng sẽ được đền đáp bằng kết quả cuối (ngon nghẻ trẻ khỏe :o). Một điều cũng rất quan trọng là duy trì kỹ thuật ổn định theo thời gian, và lưu trữ dữ liệu chính xác và chi tiết. Tính ổn định và việc bảo quản tốt dữ liệu sẽ giúp bạn xác định căn nguyên của bất kỳ vấn đề nào xảy ra sau đó.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Loại màng nào phù hợp nhất với yêu cầu của bạn?<o:p></o:p>
Cẩn thận khi chọn loại màng phù hợp mà theo đó phải xem xét cẩn thận bất kỳ thành phần có liên quan khác trong chiến lược xác định của bạn. The same considerations go into the choice of membrane that go(goes???) into the choice of any other component of your detection strategy (???:eek:). Phân tử lượng protein của bạn là bao nhiêu? Bạn sẽ sử dụng phương pháp xác định nào, và phương pháp đó có yêu cầu gì đặc biệt về màng không? Bạn có định rửa giải và tái dò không? (Xem Bảng 13.2.)
<o:p></o:p>
Nitrocellulose dễ thấm và ít tạo nền (bachground). Nhưng nó có nhược điểm là dễ vỡ, đặc biệt là khi khô nên không được sử dụng nếu phải rửa giải và tái dò. Người ta đã tạo ra loại màng nitrocellulose cải tiến mà có bề mặt nitrocellulose phủ trên vật liệu cứng dạng mạng (core or “web”). Điều này trả giá bằng việc tạo nhiều nền hơn.
<o:p></o:p>
Màng PVDF (polyvinylidene difluoride) vững hơn và có khả năng liên kết với protein tốt hơn nitrocellulose. Tuy nhiên, chúng kị nước mạnh: mạnh đến mức mà cần làm ẩm với methanol trước khi cân bằng trong dung dịch đệm. Khi làm với màng PVDF, nên chú ý để chắc chắn màng không bị khô do quá trình block, ủ kháng thể, rửa giải hay đo thất thường. Nếu màng thực sự khô, nên cân bằng lại trong methanol và sau đó trong dung dịch đệm. Ái lực của PVDF với protein làm cho việc chuyển hiệu quả và đạt hiệu quả cao khi đo, nhưng lại khó khăn hơn vì gặp các vấn đề về nền. Lựa chọn màng PVDF khi cần rửa giải và tái dò.<o:p></o:p>
 

happyfly

Member
Người ta có cung cấp các loại màng với nhiều kích thước lỗ mạng khác nhau. Kích thước tiêu chuẩn là 0.45 micron phù hợp với hầu hết ứng dụng. Cũng phổ biến là loại màng 0.2 hay thậm chí là 0.1 micron: loại nhỏ hơn phù hợp khi chuyển protein có phân tử lượng thấp, khoảng dưới 12 kDa. Hiệu quả việc chuyển sẽ giảm khi sử dụng màng dưới 0.1 micron.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Việc phong bế (Blocking)<o:p></o:p>
Tất cả các loại màng chuyển đều có ái lực cao đối với protein. Mục đích của việc phong bế đơn giản là ngăn chặn liên hết không đúng của kháng thể đang sử dụng bằng cách làm bão hòa tất cả không gian liên kết còn lại của màng với một số protein không liên quan. (Để thảo luận chi tiết hơn, xem Amersham, n.d., mà những phần sau đây hầu hết được lấy ra từ tài liệu này)<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Chất phong bế nào phù hợp nhất với nhu cầu của bạn?<o:p></o:p>
Khi phong bế, protein thường sử dụng nhất là sữa bột không béo, được biết tới là “blotto”, sử dụng dưới dạng PBS chứa 0.1% Tween-20. Cũng có thể sử dụng bất kỳ loại sữa bột không béo nào có trưng bày tại cửa hàng. <o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Gelatine thu từ nhiều nguồn khác nhau, nhưng người ta coi gelatine da cá là tốt nhất cho Western blot. Thường sử dụng gelatin cá ở nồng độ 2%. Đây là chất phong bế hiệu quả và không tạo gel (không định hình) tại 4°C ở nồng độ này.<o:p></o:p>
<o:p> </o:p>
Người ta cung cấp albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin-BSA) cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau. BSA thường phù hợp với blot hay ứng dụng miễn dịch (Bovine serum albumin (BSA) is available in a wide range of grades. Usually a blotting or immunological grade of BSA is appropriate.) Nó rẻ hơn gelatin cá và có thể sử dụng ở nồng độ 2%.<o:p></o:p>
Huyết thanh loại thường (bào thai cừu hoặc ngựa) cũng đôi khi được sử dụng ở nồng độ 10%. Đây có thể là tác nhân phong bế hiệu quả, nhưng khá tốn kém. Do huyết thanh chứa globulin miễn dịch nên nó không hợp với Protein A và một số loại kháng thể thứ cấp. <o:p></o:p>
Casein có thể được sử dụng ở nồng độ 1%, nhưng rất khó hòa casein khô vào dung dịch. Casein và casein hydrolysate là thành phần chính trong các chất phong bế thương mại.<o:p></o:p>
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Người ta cung cấp albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin-BSA) cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau. BSA thường phù hợp với blot hay ứng dụng miễn dịch (Bovine serum albumin (BSA) is available in a wide range of grades. Usually a blotting or immunological grade of BSA is appropriate.)
in a wide range of grades: nhiều cấp chất lượng khác nhau
blotting or immunological grade of BSA: BSA loại dùng cho miễn dịch hoặc blot
 

Similar threads

Facebook

Top