Thể tích phản ứng PCR mà bạn đã chạy là bao nhiêu?

[viet23ht]

Bạn đã chạy thể tích PCR nhỏ nhất là bao nhiêu, trên máy PCR của hãng nào, khi chạy có giá nhựa để ổn định nhiệt độ phản ứng không?
Nếu thấy kinh nghiệm của mình có ích thì chia sẻ cho mọi người!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Giá nhựa để ổn nhiệt độ phản ứng là cái gì nhỉ?

 

[viet23ht]

Chỉ rất ít máy PCR dùng giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt. Hiệu quả của giá nhựa thể hiện rõ nhất khi tối ưu phản ứng PCR.
Mình đã chạy 7,5 ul phản ứng, nhưng chắc do hoá chất dùng nghiên cứu từ nhiều hãng (để tiết kiệm chi phí mà) nên không dám để thể tích thấp hơn 10 ul.
Thế mà hôm rồi nghe có phòng thí nghiệm làm phản ứng với 5 ul
Choáng luôn.

 

[Lê Đức Dũng]

khiếp , gì mà keo thế !!

 

[Nguoi nhai]

Chỉ rất ít máy PCR dùng giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt. Hiệu quả của giá nhựa thể hiện rõ nhất khi tối ưu phản ứng PCR.
Mình đã chạy 7,5 ul phản ứng, nhưng chắc do hoá chất dùng nghiên cứu từ nhiều hãng (để tiết kiệm chi phí mà) nên không dám để thể tích thấp hơn 10 ul.
Thế mà hôm rồi nghe có phòng thí nghiệm làm phản ứng với 5 ul
Choáng luôn.

Minh da chay the tich nho nhat la 10 ul ( Bio Mix 5 ul , sd H20 2.6 ul f primer 0.2 ul and R primer 0.2 ul, DNA 2 ul. Neu that su co the chay voi 7.5 ul hoac 5 ul co the tiet kiem duoc nhieu hoa chat co the thu xem sao.

 

[VET]

Nói các bạn đừng cười. Mình chưa bao giờ thử chạy ở thể tích nhỏ như vậy, khi chạy gradient mình cũng chỉ dám chạy ở thể tích 20ul.
Lab mình cũng có cái máy mới, mình thấy có hay cái giá nhựa như hai hàng của các tube nối với nhau mà mình không biết có phải là giá nhựa mà bạn Viet23ht nói đến không?

 

[voh5]

Chỉ rất ít máy PCR dùng giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt. Hiệu quả của giá nhựa thể hiện rõ nhất khi tối ưu phản ứng PCR.
Mình đã chạy 7,5 ul phản ứng, nhưng chắc do hoá chất dùng nghiên cứu từ nhiều hãng (để tiết kiệm chi phí mà) nên không dám để thể tích thấp hơn 10 ul.
Thế mà hôm rồi nghe có phòng thí nghiệm làm phản ứng với 5 ul
Choáng luôn.

Thực sự làm PCR với bán máy PCR cũng khá nhiều, nhưng nghe thuật ngữ này không hiểu lắm. Giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt? Nghĩa là cái giá đấy để chứa hóa chất / mix phản ứng (= PCR plate), hay là cái giá để xếp ống PCR vào, sau đó rồi xếp ống PCR vào block nhiệt thế bạn??? Chứ hình dung người ta xếp ống PCR vào giá = NHỰA, rồi xếp giá đấy vào block nhiệt, thì chẳng hiểu nó gia nhiệt kiểu gì, hay là mấy máy PCR gia nhiệt bằng công nghệ thổi khí?

Mình có một vai giả thiết như thế này:
1. giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt = PCR Plate (dạng như đĩa 96 giếng).
2. giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt = PCR-strip (cái dây 8 ống PCR mình hay gặp í bà con).
3. giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt = 384-well plate (dùng cho dạng block 384 giếng của máy PCR).
4. giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt = PCR cooler (giá giữ lạnh cho ống PCR, loại thay đổi màu sắc khi nhiệt độ thay đổi í).

Còn về thể tích PCR chỉ 5microlit, mìnhchưa đọc hay tìm hiểu, nhưng thật ra chẳng có gì phải choáng, ít nhất là khi PTN của bạn tiệm cận tới cái ro-bot mix mẫu thì có thể set-up phản ứng như thế ngon lành mà hiệu quả vẫn cao.

 

[viet23ht]

hehe, giá nhựa ở đây là giá để đựng 96 tub, công nghệ gia nhiệt bằng thổi khí
Lab chỗ mình cũng sử dụng robot để set up, nhưng mà ko thể setup phản ứng 5ul được đâu
Choáng là vì tay nghề người ta cao, thao tác quá chuẩn trong điều kiện pipet được hiệu chuẩn 6 tháng 1 lần ấy mà

 

[gauden_nt]

Mình đã chạy PCR với thể tích là 5ul, kết quả vẫn tốt. Các bạn cứ thử xem!

 

[anhtran89]

a chị e làm nhiều về PCR cho e hỏi chút...
Trong phương pháp Multiplex PCR e muốn nhân dòng 3 đoạn ADN có nhiệt độ gắn mồi khác nhau (vd: 56, 58 và 62 độ) . Bác nào giúp thiết kế chu trình nhiệt của phản ứng PCR đó. Cảm ơn nhiều!

 

[viet23ht]

a chị e làm nhiều về PCR cho e hỏi chút...
Trong phương pháp Multiplex PCR e muốn nhân dòng 3 đoạn ADN có nhiệt độ gắn mồi khác nhau (vd: 56, 58 và 62 độ) . Bác nào giúp thiết kế chu trình nhiệt của phản ứng PCR đó. Cảm ơn nhiều!

Nhanh nhất là thiết kế lại 3 mồi chạy cùng một nhiệt độ.
Nếu không thì chịu khó mò tổ hợp các điều kiện PCR vậy, có thể gặp may đấy

 

[Biologist]

Chỉ rất ít máy PCR dùng giá nhựa để xếp ống PCR vào block nhiệt. Hiệu quả của giá nhựa thể hiện rõ nhất khi tối ưu phản ứng PCR.
Mình đã chạy 7,5 ul phản ứng, nhưng chắc do hoá chất dùng nghiên cứu từ nhiều hãng (để tiết kiệm chi phí mà) nên không dám để thể tích thấp hơn 10 ul.
Thế mà hôm rồi nghe có phòng thí nghiệm làm phản ứng với 5 ul
Choáng luôn.

Khi thuc hien "high-throughput" PCRs, cac phong thi nghiem o My va Anh thuong dung the tich 5-ul. Trong cac phong thi nghiem nay, doi khi cac ky thuat vien phai thuc hien >10,000 PCR reactions/ngay. Do vay, ho co the tiet kiem duoc rat nhieu hoa chat va enzyme.
Em co the tham khao them o day:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2490690/
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/31/19/e115
http://www.pnas.org/content/100/6/3059.long

 

[anhtrungbio]

Trục trặc với PCR

Em chào các bác,

Em đang thử chạy PCR với cặp mồi mới em tự thiết kế. Các thông số như sau:
- Máy PCR: Agilent Technology
- Enzyme: BioTaq polymerase
- Dung dích phản ứng: 50 microlit
- Target fragment: 3kb
- DNA template ngon lành, vì check không thấy smear, băng đậm.
- Chu trình: 95C – 5’; 95C – 30’’, 55C – 30’’, 72C – 30’’, 72C – 5’, 4C -

Theo thông số của Cty em order mồi, Tm họ đưa ra là 66 độ C, em đã giảm xuống 61 rồi 55 độ C vẫn chưa ăn thua.

Em đang băn khoăn liệu có phải do thao tác em chưa chuẩn!!! Em xin hỏi các bác là khi mình bơm dung dịch vào ống PCR, sau khi bơm thì vẫn còn 1 ít dính vào đầu tip. Em thường nhích thêm 1 chút để đẩy toàn bộ vào ống. Thao tác như vậy có được không? Liệu đó có là nguyên nhân dẫn đến thất bại không?

Theo các bác em cần làm gì bây giờ??? Thay enzyme khác hay Check lại primer....

Rất mong nhận được thông tin từ các bác!

 

[cfareast]

Em chào các bác,

Em đang thử chạy PCR với cặp mồi mới em tự thiết kế. Các thông số như sau:
- Máy PCR: Agilent Technology
- Enzyme: BioTaq polymerase
- Dung dích phản ứng: 50 microlit
- Target fragment: 3kb
- DNA template ngon lành, vì check không thấy smear, băng đậm.
- Chu trình: 95C – 5’; 95C – 30’’, 55C – 30’’, 72C – 30’’, 72C – 5’, 4C -

Theo thông số của Cty em order mồi, Tm họ đưa ra là 66 độ C, em đã giảm xuống 61 rồi 55 độ C vẫn chưa ăn thua.

Em đang băn khoăn liệu có phải do thao tác em chưa chuẩn!!! Em xin hỏi các bác là khi mình bơm dung dịch vào ống PCR, sau khi bơm thì vẫn còn 1 ít dính vào đầu tip. Em thường nhích thêm 1 chút để đẩy toàn bộ vào ống. Thao tác như vậy có được không? Liệu đó có là nguyên nhân dẫn đến thất bại không?

Theo các bác em cần làm gì bây giờ??? Thay enzyme khác hay Check lại primer....

Rất mong nhận được thông tin từ các bác!

Theo lý thuyết thì 3kb thì thời gian kéo dài chuỗi là 3 phút (1 phút/1kb). Bạn cần cho lên thử 2-2.5 min.
Và Tag poly của bạn có dùng được cho chuỗi dài ko ??? cần xem protocol. (3kb có khi phải pcr 2 mảnh rồi ghép lại). Nếu dùng polymerase kéo chuỗi >3kb thì okie.
Và quan trọng nhất, cần check lại primer.... nhờ người có kinh nghiệm thiết kế.
Template cũng phải dò nồng độ....
muối cũng phải dò nồng độ.
primer pha nồng độ cũng phải chuẩn
========
Rất nhiều thao tác cần phải cẩn thận...

Bạn hút phản ứng có thiếu, hay thừa 1 chút cũng ko ảnh hưởng đến độ nhạy đâu.
Mình làm phản ứng, hút 1-2ul, mình ko bao giờ vặn pipet về cữ đó... toàn áng chừng khoảng vài mm (tùy theo đầu côn), vẫn lên band ầm ầm. Vì bạn có vặn về 1ul-2ul cũng chẳng bao giờ hút đúng, tra đúng (nếu ko cẩn thận).

 

[anhtrungbio]

Vâng, cảm ơn bác rất nhiều! Em làm cùng 1 anh tutor người Spain là tay có nhiều kinh nghiệm, anh ấy cũng đồng ý với em về cặp mồi này. Nên trước mắt chưa thay đổi primer.

Sau khi post câu hỏi xong em cũng chợt ngớ người vì do em tính sai, khi setup nhiệt độ elongation là 30" vì tính nhầm đoạn đích là 1kb. Em vừa chạy lại tăng lên 2' ở 72 độ C. Để lát nữa check xem kết quả thế nào. Có gì em sẽ hỏi các bác tiếp.

 

[anhtrungbio]

Ôi được rồi các bác ạ => 1 băng thật là sắc nét ^^ Em vui quá! Mất 4 lần PCR oan uổng.
Hoá ra là do lỗi đặt nhiệt độ kéo dài chưa đủ thời gian. Em tăng lên 2 phút là OK.
Công việc tiếp theo sẽ là TA cloning bằng plasmid pGEMT, rồi cắt ghép tùm lum... Có gì trục trặc em lại xin ý kiến các cao nhân sau ạ.
Chân thành cảm ơn!

 

[lovekieu]

Khi thuc hien "high-throughput" PCRs, cac phong thi nghiem o My va Anh thuong dung the tich 5-ul. Trong cac phong thi nghiem nay, doi khi cac ky thuat vien phai thuc hien >10,000 PCR reactions/ngay. Do vay, ho co the tiet kiem duoc rat nhieu hoa chat va enzyme.
Em co the tham khao them o day:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2490690/
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/31/19/e115
http://www.pnas.org/content/100/6/3059.long

Về lý thuyế thì có thể chạy ở thể tích 2 ul đối với làm PCR trên slide. Thể tích phản ứng phụ thuộc vào thể tích ống chạy PCR. Nếu sử dụng ống PCR 0,2ml thì rất khó để chạy thể tích <10ul do lượng hóa chất chỉ đủ để khi bốc hơi trước khi chạm vào bề mặt nắp được gia nhiệt để quay lại. Nếu sử dụng loại plate 384 giếng có thể tích 20ul thì có thể chạy được thể tích 5ul.