Câu hỏi về tách chiết nucleic acid từ E. coli

[grass_8]

Cho một quy trình như sau :
- huyền phù vi khuẩn e.coli trong dung dịch TE
- thêm vào hỗn hợp phenol PH 8.0, chloroform, isoamylalcohol (25: 24:1), lắc rung 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu phần dịch nổi phía trên
- Thêm ethanol tuyệt đối lạnh. Đảo và ủ ống ở -20*C trong 30 phút
- Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi
- Để khô cặn và hoà cặn trong dung dịch TE
Hỏi:
- quy trình trên tách được nucleic acid loại nào?
- Quy trình trên còn thiếu những bước nào ?
Em đang ôn bài thi thực tập sinh học phân tử đại cương mà hok giải quyết được câu này ! anh chị giúp đỡ em với

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn xem lại miniprep ở E.coli để tách plasmid và so sánh với các bước.
Các bước bạn nêu trên gần giống hệt Onestep miniprep. Bạn thay TE bằng loading buffer cũng được và chẳng cần tủa cồn.

 

[Lê Đức Dũng]

phương pháp trên là phương pháp cổ điển thường đươc dùng trong giảng dạy để cho sv nắm nguyên lý.
còn thực tế bây giờ thì dùng kit ( như bác Lương chỉ) để tách và làm theo protocol có sẵn của nhà sản xuất, nhưng tất nhiên là sv nhiều nơi vãn phải học phương pháp cổ điển để trả lời những câu hỏi tại sao lại bỏ cái này vào hay làm như thế kia...

 

[Lê Đức Dũng]

DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL

1. Grow cells overnight in 500 ml broth medium.
2. Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.
3. Freeze cell suspension at -20C
4. Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.
5. Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.
6. Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.
7. Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).
8. Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.
9. Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.
10. Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).
11. Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.
12. Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.

DNA Extraction from Bacteria (Julie B. Wolf, University of Maryland, Baltimore County)
Phenol/chloroform method

[FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]TE buffer [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]10% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]20 mg/ml proteinase K [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]phenol\chloroform (50:50) [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]isopropanol [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]70% ethanol [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]3M sodium acetate pH 5.2 [/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]

[/FONT] [FONT=Verdana, Arial, Helvetica]Phase Lock GelTM (Eppendorf-Brinkmann) [FONT=Verdana, Arial, Helvetica](http://www.eppendorf.com/phaselockgel/en/phase_1.html)[/FONT][/FONT]

[FONT=Verdana, Arial, Helvetica] [/FONT]

1. Grow E. coli culture overnight in rich broth.
2. Transfer 2 ml to a 2-ml micro centrifuge tube and spin 2 min.
3. Decant the supernatant.
4. Drain well onto a Kimwipe.
5. Resuspend the pellet in 467 μl TE buffer by repeated pipetting.
6. Add 30 μl of 10% SDS and 3 μl of 20 mg/ml proteinase K, mix , and incubate 1 hr at 37[FONT=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif] ° C[/FONT].
7. Add an equal volume of phenol/chloroform and mix well but very gently to avoid shearing the DNA by inverting the tube until the phases are completely mixed. CAUTION: PHENOL CAUSES SEVERE BURNS, WEAR GLOVES GOGGLES, AND LAB COAT AND KEEP TUBES CAPPED TIGHTLY.
8. Carefully transfer the DNA/phenol mixture into a Phase Lock GelTM tube (green) and spin at 12,000 RPM for 10 min.
9. Transfer the upper aqueous phase to a new tube and add an equal volume of phenol/chloroform.
10. Again mix well and transfer to a new Phase Lock GelTM tube and spin 10 min.
11. Transfer the upper aqueous phase to a new tube.
12. Add 1/10 volume of sodium acetate. Mix.
13. Add 0.6 volumes of isopropanol and mix gently until the DNA precipitates.
14. Spool DNA onto a glass rod (or Pasteur pipet with a heat-sealed end).
15. Wash DNA by dipping end of rod into 1 ml of 70% ethanol for 30 sec.
16. Resuspend DNA in at least 200 μl TE buffer. Complete resuspension may take several days. Store DNA at 4[FONT=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif] ° C[/FONT] short term, -20 or -80 [FONT=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif] ° C[/FONT] long term.
17. After DNA has dissolved, determing the concentration by measuring the absorbance at 260 nm.

[FONT=Verdana, Arial, Helvetica] [/FONT]

 

[grass_8]

phương pháp trên là phương pháp cổ điển thường đươc dùng trong giảng dạy để cho sv nắm nguyên lý.
còn thực tế bây giờ thì dùng kit ( như bác Lương chỉ) để tách và làm theo protocol có sẵn của nhà sản xuất, nhưng tất nhiên là sv nhiều nơi vãn phải học phương pháp cổ điển để trả lời những câu hỏi tại sao lại bỏ cái này vào hay làm như thế kia...

cũng may cho em là khi thi không ra bài này! mức độ tụi em học mới chỉ là đại cương nên chỉ hiểu về cơ bản... hic...hic

 

[Huỳnh Như Ngọc Hiển]

cũng may cho em là khi thi không ra bài này! mức độ tụi em học mới chỉ là đại cương nên chỉ hiểu về cơ bản... hic...hic

Thi ra cũng không có vấn đề gì cả, tùy thuộc ông thầy yêu cầu mức độ nào thì trả lời mức độ đó.