Chỉ số ODtrong xây dựng đường cong sinh trưởng

[thangnho_12]

các anh chị giải đáp giùm em thắc mắc này với:
em sử dụng máy đo quang để đo chỉ số OD cho các mẫu môi trường lên men.
em xác định giá trị OD(610nm) =1 tương ứng với 571x10 mũ 5 tế bào trong 1ml môi trường.
rồi em đo các chỉ số OD trong suốt quá trình lên men ( mục đích là vẽ đường cong sinh trưởng) cứ 2h là đo 1 lần.
có các kết quả là :0h OD= 0.023, 2h OD = 0.042.....
rồi em lấy giá trị OD = 1 = 571x 10 mũ 5 tế bào ở trên để làm chuẩn để tính số lượng tế bào tương ứng với các giá trị OD = 0.023,OD = 0.042 cụ thể là
OD = 0.023 thì số tế bào là 0.023 x 571x10 mũ 5 tế bào.
em tính như thế có đúng không hở anh ,chị????

 

[duongdikho_mtdkh]

các anh chị giải đáp giùm em thắc mắc này với:
em sử dụng máy đo quang để đo chỉ số OD cho các mẫu môi trường lên men.
em xác định giá trị OD(610nm) =1 tương ứng với 571x10 mũ 5 tế bào trong 1ml môi trường.
rồi em đo các chỉ số OD trong suốt quá trình lên men ( mục đích là vẽ đường cong sinh trưởng) cứ 2h là đo 1 lần.
có các kết quả là :0h OD= 0.023, 2h OD = 0.042.....
rồi em lấy giá trị OD = 1 = 571x 10 mũ 5 tế bào ở trên để làm chuẩn để tính số lượng tế bào tương ứng với các giá trị OD = 0.023,OD = 0.042 cụ thể là
OD = 0.023 thì số tế bào là 0.023 x 571x10 mũ 5 tế bào.
em tính như thế có đúng không hở anh ,chị????

Chào bạn! mình cũng làm đo OD để vẽ dường cong sinh khối. Cụ thể là mình đo môi trường lên men của vi khuẩn E. coli Bl21 Tái tổ hợp! Mình không biết là bạn đang đo môi trưòng lên men của con vi khuẩn nào nhưng bạn nuôi cấy tĩnh hay động, có sử dụng máy lắc hay không?
Riêng con của mình thì mình đo ở các khoảng thời gian là 4h, 8h, 24h,...72h. Mục đích của mình cũng là để vẽ đường cong sinh khối và xem xem nó phát triển tới giai đoạn nào thì nên dừng quá trình nuôi cấy!

Mình thì đo ở 2 bước sóng là: 600 và 620nm.

Còn về tính số lượng tế bào thì mình cũng chưa rành lắm! Bạn có thể cho mình hỏi là bạn tham khảo tài liệu nào mà lại lấy được các số liệu đó vậy (571x 10 mũ 5)!

 

[trungtien1088]

Mình thì đo ở 2 bước sóng là: 600 và 620nm.

Còn về tính số lượng tế bào thì mình cũng chưa rành lắm! Bạn có thể cho mình hỏi là bạn tham khảo tài liệu nào mà lại lấy được các số liệu đó vậy (571x 10 mũ 5)!

Mình cùng câu hỏi như thế này !!!!
Việc đo ở OD ở các bước sóng khác nhau phụ thuộc vào điều gì? Mình thấy mỗi loại vsv sẽ đo ở một bước sóng khác nhau? Ví dụ như vi khuẩn hoặc nấm sẽ đo )D =540-590, xạ khuẩn thì 620... vậy bước sóng có ảnh hưởng thế nào?
Hơn nữa đo OD sẽ ko được chính xác khi vsv đang ở pha cân bằng, lúc này số lượng vsv sinh ra= lượng chết đi, độ đục của môi trường sẽ có lẫn cả 2, lúc đó bạn sẽ tính như thế nào???

 

[orion8x]

Độ hấp thụ UV light của mỗi chất là khác nhau ở bước sóng khác nhau. Nói đơn giản dễ hiểu thì vi khuẩn sễ hấp thụ tia uv ở bước sóng 600 và 620nm. Chắc sau này e sẽ đc học trong môn Sinh hóa phân tích thôi, đừng thắc mắc vội .
Mất bao lâu và ở điểu kiện nào để vi khuẩn đặt tới pha cân bằng!? Khi nào trả lời đc câu này thì a nghĩ e hiểu mình biết làm thể nào để tránh pha cân bằng khi đo Absorbance.

 

[trungtien1088]

Độ hấp thụ UV light của mỗi chất là khác nhau ở bước sóng khác nhau. Nói đơn giản dễ hiểu thì vi khuẩn sễ hấp thụ tia uv ở bước sóng 600 và 620nm. Chắc sau này e sẽ đc học trong môn Sinh hóa phân tích thôi, đừng thắc mắc vội .
Mất bao lâu và ở điểu kiện nào để vi khuẩn đặt tới pha cân bằng!? Khi nào trả lời đc câu này thì a nghĩ e hiểu mình biết làm thể nào để tránh pha cân bằng khi đo Absorbance.

Mình ko làm về VK nên mình ko nắm rõ, nhưng theo các tài liệu thì quá trình sinh trưởng và phát triển của VK thường tối đa là 3 ngày (nuôi cấy lỏng, tĩnh) lúc đó VK đã tới pha suy vong. Nên thời gian ko lâu đâu.

Ở điều kiện nào thì ở những môi trưởng đặc trưng cho VK thôi, nhiệt độ phòng 30 độ C. Đo OD là mình đo quá trình sinh trưởng của nó, nghĩa là phải đo theo thời gian --> làm sao tránh khỏi đc pha cân bằng? Vấn đề mình hỏi là liệu KQ đo OD có chính xác khi chủng vsv ở pha cân bằng ko?

Mình muốn hỏi có tài liệu nào quy định giá trị OD với từng chủng vsv ko? Làm sao biết đc OD nào là chính xác, là phù hợp với chủng vsv vật đó?

Vậy ngoài PP đo OD thì còn pp nào nữa ko? Phương pháp đếm khuẩn lạc? Phương pháp tính sinh khối dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối...????

 

[orion8x]

vi khuẩn kg giống như con người, 1 người có tuổi thọ trong khoảng thời gian nhất định, còn vi khuẩn thì dựa vào môi trường. Các pha hình thành là do sự suy kiệt nguồn dinh dưỡng và môi trường sống.
Và trong tất cả các thí nghiệm về vi khuẩn, chúng ta đều phải thực hiện 1 bước rất quan trọng: Diluted - pha loãng vi khuẩn vào 1 môi trường mới. Điều này giống như thay đồ ăn cho thú cưng. Thế là vi khuẩn lại có thể ung dung mà sống từ pha đầu tiên ^^.
Thực tình mà nói thì mình kg biết nhiều lắm về vấn đề này. và cũng kg biết giải thích thế nào bời nó liên quan tới vật lý nhiều hơn là sinh học. Mình chỉ biết là, OD chúng ta dùng là bước sóng hấp thụ tối đa của vật chất. Và nó có thể tính toán ra đc bằng Định luật Beer-Lambert. Vì vi khuẩn kg phải là 1 chất đồng nhất, nên bước sóng áp dụng cho chúng là 1 khoảng, kg phải 1 số. Chi tiết hơn thì vượt quá khả năng của minh.
Thêm 2 phương pháp mình biết đó là dùng máy đo và đếm dưới kinh hiển vi ^^

 

[orion8x]

Ah, để giới thiệu luôn cái Beer-Lambert's Law nếu Bạn chưa biết.

A= e.c.l
Trong đó:
A= Độ hấp thụ
e = extinction coeficiency (sz, kg biết TV nó là gì). Mỗi chất có 1 hằng số e riêng. vd như Protein là 280, dsDNA là 260. Đây cũng là bước sóng mà bạn dùng để đo. (vd do DNA dùng bước sóng 260nm)
l = độ dài của cuvette, tiêu chuẩn là 1cm.
___________
Nếu thắc mắc của bạn vẫn còn và bạn đang học Công nghệ Sinh thì yên tâm, sẽ đc học trong môn Sinh hóa phân tích ^^. Chỉ sợ tới lúc đó càng hỏi càng rối thôi.

 

[trungtien1088]

vi khuẩn kg giống như con người, 1 người có tuổi thọ trong khoảng thời gian nhất định, còn vi khuẩn thì dựa vào môi trường. Các pha hình thành là do sự suy kiệt nguồn dinh dưỡng và môi trường sống.
Và trong tất cả các thí nghiệm về vi khuẩn, chúng ta đều phải thực hiện 1 bước rất quan trọng: Diluted - pha loãng vi khuẩn vào 1 môi trường mới. Điều này giống như thay đồ ăn cho thú cưng. Thế là vi khuẩn lại có thể ung dung mà sống từ pha đầu tiên ^^.
Thực tình mà nói thì mình kg biết nhiều lắm về vấn đề này. và cũng kg biết giải thích thế nào bời nó liên quan tới vật lý nhiều hơn là sinh học. Mình chỉ biết là, OD chúng ta dùng là bước sóng hấp thụ tối đa của vật chất. Và nó có thể tính toán ra đc bằng Định luật Beer-Lambert. Vì vi khuẩn kg phải là 1 chất đồng nhất, nên bước sóng áp dụng cho chúng là 1 khoảng, kg phải 1 số. Chi tiết hơn thì vượt quá khả năng của minh.
Thêm 2 phương pháp mình biết đó là dùng máy đo và đếm dưới kinh hiển vi ^^

Cảm ơn bạn đã trả lời...
Nuôi cấy trong quy mô PTN với pp lên mên liên tục nên chắc chắc quá trình sinh trưởng phải qua 4 giai đoạn, còn sử dụng thiết bị lên men với phương pháp lên men ko liên tục thì mình có thể bổ sung chất dinh dưỡng, điều chỉnh pH thích hợp... nên quá trình sinh trưởng của vsv sẽ qua 3 giai đoạn, do đó vsv luôn phát triển và ko suy vong.
Mình thấy các bạn sinh viên đa số đo OD theo các tài liệu đã công bố nhưng khi hỏi vì sao thì lại ko nắm rõ, dù sao mình muốn biết bản chất của vấn đề thì sẽ giúp năm vững và nhớ kỹ kiến thức hơn thôi...
Hic hic...
Vậy ai biết về vấn đề này giúp mình với nhé

 

[orion8x]

Mình kg hiểu bạn đang thắc mắc cái gì nữa (ý là phần vi khuẩn). Đúng là trong môi trường nuôi cấy, vi sinh vật sẽ phát triển đủ 4 giai đoạn nếu để đủ lâu. Nhưng nếu bạn pha loãng vào một môi trường khác, thì vi sinh vật đó sẽ bắt đầu ại từ pha 1. Và phải mất một thời gian chúng mới đạt tới pha cân bằng. Thơi gian nảy đủ lâu để chúng ta có để đo độ hấp thụ của môi trường.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thông thường để xác định số lượng tế bào thì phương pháp chuẩn nhất là đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Một phương pháp khác cũng được sử dụng là pha loãng tới hạn rồi trải lên dĩa và đếm khuẩn lạc.

Trường hợp của bạn dùng OD để đo mật độ tế bào, thế thì không nên chuyển đổi ra số lượng nếu như bạn chưa dựng đường chuẩn OD vs số lượng. Bạn vẫn có thể giữ giá trị OD nguyên như vậy và vẽ đường cong sinh trưởng mà. Còn nếu bạn muốn tính số lượng chính xác, thì phải dựng đường chuẩn OD vs Số tế bào và chỉ lấy những giá trị OD nằm trong khoảng tương quan tuyến tính.

Lưu ý giá trị OD và mật độ tế bào nó cũng chỉ tương quan trong một khoảng nhất định, thường khi OD dưới 1. Vậy nên nếu bạn đo OD ở các phase cuối thì phải pha loãng ra rồi đo.

OD chỉ đo mật độ tế bào nên không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Tuy nhiên với vi khuẩn thì có lẽ vấn đề chết là một chuyện hi hữu nên số lượng tế bào đếm được coi như toàn là tế bào sống cả.

 

[bonbonsin]

Theo như mình biết thì khi xác định độ tế bào phương pháp đo OD thì:
Bước sóng, tùy thuộc vào môi trường + VSV nên với mỗi môi trường và mỗi loại VSV người ta sẽ tiến hành khảo sát các bước sóng khác nhau >>> tìm ra được bước sóng có độ hấp thụ OD là cao nhất (đối với mình khi làm thí nghiệm thì khâu này thường không tiến hành do mất thời gian và bước sóng mà mình chọn thường do giảng viên đưa cho).
Xác định mật độ tế bào, thì trước hết bạn phải có đường chuẩn (đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào, việc xây dựng đường này bằng cách lấy giá trị OD = 0.1; 0.2; ... 1.0, rồi sau đó xác định mật độ tế bào ứng với 1 giá trị OD); sau đó dựa vào đường chuẩn để xác định mật độ tế bào, theo như mình biết là khi xây dựng đường tương quan tuyến tính thì R2 (R bình phương) phải >= 0.96.
Bên cạnh đó, việc xác định mật độ tế bào, bạn có tiến hành bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu (nhược điểm là không phân biệt tế bào sống/chết), hoặc tiến hành cấy trãi (hơi mất thời gian nhưng là phương pháp chính xác nhất). Còn xác định mật độ tế bào bằng OD thì giá trị (mật độ tế bào) của nó sẽ lớn hơn cả đếm bằng buồng đếm hồng cầu do trong môi trường nuôi cấy không chỉ có VSV hấp thụ mà cơ chất, các sản phẩm trao đổi chất và các sản phẩm bị VSV tiết ra môi trường cũng có khả năng hấp thụ ánh sáng.

 

[ToanNguyen]

Theo như mình biết thì khi xác định độ tế bào phương pháp đo OD thì:
Bước sóng, tùy thuộc vào môi trường + VSV nên với mỗi môi trường và mỗi loại VSV người ta sẽ tiến hành khảo sát các bước sóng khác nhau >>> tìm ra được bước sóng có độ hấp thụ OD là cao nhất (đối với mình khi làm thí nghiệm thì khâu này thường không tiến hành do mất thời gian và bước sóng mà mình chọn thường do giảng viên đưa cho).
Xác định mật độ tế bào, thì trước hết bạn phải có đường chuẩn (đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào, việc xây dựng đường này bằng cách lấy giá trị OD = 0.1; 0.2; ... 1.0, rồi sau đó xác định mật độ tế bào ứng với 1 giá trị OD); sau đó dựa vào đường chuẩn để xác định mật độ tế bào, theo như mình biết là khi xây dựng đường tương quan tuyến tính thì R2 (R bình phương) phải >= 0.96.
Bên cạnh đó, việc xác định mật độ tế bào, bạn có tiến hành bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu (nhược điểm là không phân biệt tế bào sống/chết), hoặc tiến hành cấy trãi (hơi mất thời gian nhưng là phương pháp chính xác nhất). Còn xác định mật độ tế bào bằng OD thì giá trị (mật độ tế bào) của nó sẽ lớn hơn cả đếm bằng buồng đếm hồng cầu do trong môi trường nuôi cấy không chỉ có VSV hấp thụ mà cơ chất, các sản phẩm trao đổi chất và các sản phẩm bị VSV tiết ra môi trường cũng có khả năng hấp thụ ánh sáng.

bạn Bonbonsin thân, việc xây dựng đường OD và số lượng vi khuẩn tương quan không nhất thiết phải lấy 0.1, 0,2 ... 0.9, 1.0, ma bạn chỉ cần lấy các điểm bất kỳ ( miễn là không quá sai lệch ). lý do la vi rất mất thời gian để chỉnh được OD đẹp như thế , hơn nữa nó cũng không có ý nghĩa cho việc xây dựng đường OD. Thậm chí bạn chỉ cần đo OD ở một giá trị ~~1, sau đó pha loãng nhìều lần , do OD tại các điểm đó , sau đó chỉ cần đếm số lượng vk tại OD ~~ 1 ( không nhất thiết 1 đâu nhé ). Như vậy bạn đã có thể làm đường tương quan OD Vs só lượng vk ( cfu). khi pha loãng cần làm cẩn thận thì nó sẽ chuẩn .