Điện di DNA khó phân tách các band

[Hà Thị Minh Thi]

Mình đang thực hiện một multiplex PCR với hai sản phẩm kích thước 472 bp và 495 bp. Mình điện di trên gel agarose 2% kích thước gel 6,5 cm x 10 cm (rộng x dài), điện thế 45V trong 3 giờ nhưng vẫn rất khó tách hai băng mặc dù băng đã chạy đến gần hết gel. Bạn nào có kinh nghiệm thì chỉ giúp mình với. Mình có nên dùng Nusieve 3:1 agarose không? Cách đổ gel và sử dụng gel này có khác gì với gel agarose thường không? Mình cám ơn nhiều.

 

[AdaptivePlasticity]

Mình đang thực hiện một multiplex PCR với hai sản phẩm kích thước 472 bp và 495 bp. Mình điện di trên gel agarose 2% kích thước gel 6,5 cm x 10 cm (rộng x dài), điện thế 45V trong 3 giờ nhưng vẫn rất khó tách hai băng mặc dù băng đã chạy đến gần hết gel. Bạn nào có kinh nghiệm thì chỉ giúp mình với. Mình có nên dùng Nusieve 3:1 agarose không? Cách đổ gel và sử dụng gel này có khác gì với gel agarose thường không? Mình cám ơn nhiều.

2 band có độ dài khá gần nhau thế khó tách bằng điện di thông thường lắm. Bạn có thể dùng loại điện di này DDGE Denaturing Detergent Gradient Gel Electrophoresis xem sao, hoặc có thể clone PCR mix của 2 band đó vào vector thì sẽ tách được chúng. Cái máy DDGE ở viện CNSH hà nội cũng có thì phải.
Ai có cách nào tách bằng điện di thường chia sẻ kinh nghiệm với nhé.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Mình đang thực hiện một multiplex PCR với hai sản phẩm kích thước 472 bp và 495 bp. Mình điện di trên gel agarose 2% kích thước gel 6,5 cm x 10 cm (rộng x dài), điện thế 45V trong 3 giờ nhưng vẫn rất khó tách hai băng mặc dù băng đã chạy đến gần hết gel. Bạn nào có kinh nghiệm thì chỉ giúp mình với. Mình có nên dùng Nusieve 3:1 agarose không? Cách đổ gel và sử dụng gel này có khác gì với gel agarose thường không? Mình cám ơn nhiều.

Dùng DGGE (chứ không phải DDGE) cũng được nhưng tốt nhất là thiết kế lại primer để 2 sản phẩm đích có kích thước khác nhau tối thiểu 100bp.

 

[Hà Thị Minh Thi]

Cám ơn các bạn nhiều, nhưng cái chính là mình chỉ có thể sử dụng những thiết bị có sẵn tại lab của mình thôi. Vì vậy mình muốn hỏi nên thay đổi chế độ điện di như thế nào. Có nên thử với loại Nusieve agarose không vì thấy nó được quảng cáo là có độ phân giải cao. Một số tác giả đã dùng nó với trong các multiplex PCR có nhiều sản phẩm PCR và có vài sản phẩm kích thước chênh nhau chỉ 20-30 bp thôi. Vì vậy, ai có từng làm những trường hợp tương tự rồi thì cho mình học hỏi kinh nghiệm với.

 

[AdaptivePlasticity]

Cám ơn các bạn nhiều, nhưng cái chính là mình chỉ có thể sử dụng những thiết bị có sẵn tại lab của mình thôi. Vì vậy mình muốn hỏi nên thay đổi chế độ điện di như thế nào. Có nên thử với loại Nusieve agarose không vì thấy nó được quảng cáo là có độ phân giải cao. Một số tác giả đã dùng nó với trong các multiplex PCR có nhiều sản phẩm PCR và có vài sản phẩm kích thước chênh nhau chỉ 20-30 bp thôi. Vì vậy, ai có từng làm những trường hợp tương tự rồi thì cho mình học hỏi kinh nghiệm với.

Đọc trong cái link này thấy 1 đứa nó bảo dùng cái Nusieve có thể phân giải được band cách nhau 20bp. Bạn thử dùng coi, nhớ thông báo kết quả ch mình học tập nhé.
http://www.biocompare.com/Articles/ProductReview/23/NuSieve-31.html

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

The co cai ladder nao danh cho dien di DNA agarose binh thuong (khong phai PFGE) co phu kich thuoc tu 10 kbp-20kbp khong nhi?

 

[viet23ht]

Bạn chạy tăng điện áp lên 110 v xem, pha nồng độ gel 1,5%.
Để mai check lại đã, mình hay chạy thằng này đấy, mà các sản phẩm chênh nhau vài nu đến vài chục nu nên điện di agarose thường chỉ để kiểm tra có sản phẩm không. Tuy nhiên vẫn phân biệt được, quan trọng là dùng agar loại nào thôi.

 

[Hà Thị Minh Thi]

Bạn chạy tăng điện áp lên 110 v xem, pha nồng độ gel 1,5%.
Để mai check lại đã, mình hay chạy thằng này đấy, mà các sản phẩm chênh nhau vài nu đến vài chục nu nên điện di agarose thường chỉ để kiểm tra có sản phẩm không. Tuy nhiên vẫn phân biệt được, quan trọng là dùng agar loại nào thôi.

Cám ơn bạn nhiều nhé. Mình sẽ thử theo điều kiện bạn gợi ý.

 

[TranDucTrung]

Theo mình được biết thì điện di gel agarose không cho độ phân giải cao lắm đâu, bất kể sử dụng nồng độ gel cao đến 3-4%. Trong trường hợp cần phân tách phát hiện các band có kích thước hơn kém nhau vài chục nu như của bạn thì tại sao không thử dùng gel polyacrylamide (PAGE) nhỉ. Mình làm DNA fingerprinting bằng mồi SSR có các band sản phẩm chỉ hơn kém nhau 20 nu sử dụng PAGE 5% rất hiệu quả, có những trường hợp điện di trên gel agarose chỉ cho một band hơi nhòe nhưng khi dùng PAGE thì thấy rõ hai band riêng biệt.
Theo như mình đang làm thì với bản gel 8x10 cm (rxc) dùng nồng độ polyacrylamide 10% cho kết quả phân tách cực tốt. Có điều cần lưu ý là với PAGE, các band DNA còn có thể bị phân tách theo hình dạng chứ không chỉ theo khối lượng (phương pháp Conformation Sensitive Gel Electrophoresis- CSGE) ----- Đây là mình đọc được như vậy chứ không biết thực tế nó ảnh hưởng ra sao. Bạn nào biết rõ hơn xin cho ý kiến nhé.:hum:

 

[mabu9669]

Tui cũng nghĩ nên thử với gel polyacrylamide. Gel này kích thước lỗ sẽ nhỏ hơn nên phân tách được dễ hơn.
Nếu ko thì thiết kế mồi lại 1 xí. ko cần dùng các phương pháp đắt tiền kia đâu

 

[Hà Thị Minh Thi]

Cảm ơn tất cả mọi người đã góp ý. Mình đã thiết kế lại mồi rồi, kích thước sản phẩm mới là 418 bp thay vì 472 bp. Bây giờ khoảng cách hai sản phẩm là 77 bp. Chúng đã dễ dàng phân tách trên gel agarose 1%, chạy 80V trong 1 giờ 15 phút.

 

[Nguyễn Phước Hùng]

Nếu bạn muốn tách sản phẩm PCR có kích thước gần nhau thì cứ giảm % gel xuống, o.5% là ok thôi. Vả lại chạy diện di bạn cứ chạy 100-135V là được, chạy thấp quá lâu có kết quả xem nhưng lại mau thất vọng nếu kết quả không tốt! ^^

 

[Ho Huu Tho]

Nếu bạn muốn tách sản phẩm PCR có kích thước gần nhau thì cứ giảm % gel xuống, o.5% là ok thôi. Vả lại chạy diện di bạn cứ chạy 100-135V là được, chạy thấp quá lâu có kết quả xem nhưng lại mau thất vọng nếu kết quả không tốt! ^^

Muốn tăng độ phân giải thì phải tăng nồng độ gel agarose chứ sao làm ngược vậy.

 

[voh5]

Cảm ơn tất cả mọi người đã góp ý. Mình đã thiết kế lại mồi rồi, kích thước sản phẩm mới là 418 bp thay vì 472 bp. Bây giờ khoảng cách hai sản phẩm là 77 bp. Chúng đã dễ dàng phân tách trên gel agarose 1%, chạy 80V trong 1 giờ 15 phút.

Hợp lý Đang định vào comment thì thấy chị Thi đã trả lời rồi .
Thường thì chạy điên di ADN để phân tách khoảng dưới 30-50 nu thì tiến hành trên gel Agarose nồng độ cao còn may ra có hiệu quá, còn với khoảng dưới 20 nu thì coi như ... xong, hầu hết không phân biệt được! Cách đơn giản nhất mà người ta vẫn làm là PAGE, chứ chuyển sang làm cái Điện di gradient Biến tính gì gì đấy thì quá phức tạp, chưa kể, muốn làm được thì phải trang bị cả bộ complet này để làm (trong khi hầu hết các PTN đều có cái điện di đứng. Em đoán trong Viện KH ở Huế chắc cũng đầy chị nhỉ, dỡ phải thay hóa chất, hay thiết bị làm gì cho phức tạp.

 

[Ho Huu Tho]

Muốn tăng độ phân giải thì phải tăng nồng độ gel agarose chứ sao làm ngược vậy.

Có người bạn không đồng ý với mình và viết mail phản đối mình về việc này. Bạn đó đồng ý với ý kiến trước đó như sau:

Nếu bạn muốn tách sản phẩm PCR có kích thước gần nhau thì cứ giảm % gel xuống, o.5% là ok thôi. Vả lại chạy diện di bạn cứ chạy 100-135V là được, chạy thấp quá lâu có kết quả xem nhưng lại mau thất vọng nếu kết quả không tốt! ^^

Mình không biết thế nào, nhờ bạn nào có kinh nghiệm kết luận giúp. À, tiện thể nhắn với admin là có bạn nói tài khoản của bạn í không post được bài là thế nào nhỉ?

 

[newbie]

Thế chạy DNA trên gel polyacrylamide có khác di chạy điện di protein trên đó không?

 

[voh5]

Mình không biết thế nào, nhờ bạn nào có kinh nghiệm kết luận giúp.

Em làm điện di ADN cũng khá lâu nhưng kiểu này cũng ... không kết luận được cái này bác Thọ à! Cách tốt nhất là bác khuyên bạn ấy đọc kỹ về cấu tạo gel Agarose bác à.

Thế chạy DNA trên gel polyacrylamide có khác di chạy điện di protein trên đó không?

Chẳng biết trả lời thế nào bác Newbie à? Cơ bản ở chỗ cách hỏi của bạn làm em không trả lời được !

 

[Ho Huu Tho]

Thế chạy DNA trên gel polyacrylamide có khác di chạy điện di protein trên đó không?

Đúng là newbie cần hỏi cụ thể hơn, chứ khác thì đương nhiên là khác rồi, và giống thì cũng có nhiều cái giống. Biết được ý bạn thực sự muốn hỏi thì mọi người mới "gãi đúng chỗ ngứa" của bạn.

 

[nvhung]

Nếu bạn muốn tách sản phẩm PCR có kích thước gần nhau thì cứ giảm % gel xuống, o.5% là ok thôi. Vả lại chạy diện di bạn cứ chạy 100-135V là được, chạy thấp quá lâu có kết quả xem nhưng lại mau thất vọng nếu kết quả không tốt! ^^ Mình không biết thế nào, nhờ bạn nào có kinh nghiệm kết luận giúp.

Ồ chuyện này là đượng nhiên rồi. về mặt cấu tạo gel Agarose là một giá thể dạng lưới( có thể gọi là các đượng ống) để cho DNA di chuyển dưới tác dụng của diện trường. Vì vậy ở nồng độ gel thấp thí kích thước của các mắt lưới sẽ lớn vì vậy khả năng phân tách các đoạn DNA có kích thước sẽ kém hơn. khi chúng ta tăng nồng độ gel lên thì các mắt lưới sẽ trở nên nhỏ hơn vì vậy làm tăng hiệu quả phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau.

 

[Ho Huu Tho]

Nếu bạn muốn tách sản phẩm PCR có kích thước gần nhau thì cứ giảm % gel xuống, o.5% là ok thôi. Vả lại chạy diện di bạn cứ chạy 100-135V là được, chạy thấp quá lâu có kết quả xem nhưng lại mau thất vọng nếu kết quả không tốt! ^^ Mình không biết thế nào, nhờ bạn nào có kinh nghiệm kết luận giúp.

Ồ chuyện này là đượng nhiên rồi. về mặt cấu tạo gel Agarose là một giá thể dạng lưới( có thể gọi là các đượng ống) để cho DNA di chuyển dưới tác dụng của diện trường. Vì vậy ở nồng độ gel thấp thí kích thước của các mắt lưới sẽ lớn vì vậy khả năng phân tách các đoạn DNA có kích thước sẽ kém hơn. khi chúng ta tăng nồng độ gel lên thì các mắt lưới sẽ trở nên nhỏ hơn vì vậy làm tăng hiệu quả phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau.

Ơ, phần trích dẫn và ý kiến của bạn là giống nhau hay khác nhau vậy?