Vấn đề về thiết kế mồi!

[caothangqm]

Hiện tại thì em đang có 1 đoạn gene cần câu ra.
Vấn đề là khi thiết kế mồi dựa trên trình tự đã biết (e gửi sang Hàn giải trình tự ), thì chỉ câu ra được một phần của đoạn gene đó. Vì vậy chỉ phục vụ được mục đích định tính (tìm xem có gene tương tự trong các chủng khác không).
Em xin hỏi bản chất của việc không amplify được hết cả đoạn gene là gì ạ?
Và hướng khắc phục chung và riêng (nếu có thể) của hiện tượng này.

Em xin cảm ơn!

P/s: e đặt câu hỏi này với mục đích để hiểu rõ hơn về cơ chế và bản chất sinh học, mong các tiền bối không "vặn" ngược lại em và yêu cầu em post gene cụ thể lên thì mới giải quyết được.

 

[dinhcatdiem]

Tín hiệu sau khi giải trình tự 2 đầu thường bị nhiễu nên không đọc được toàn vẹn nhưng bạn vẫn có trình tự của nơi giải rồi blast trên ncbi kiêm tra đúng gene mình tìm trên tác nhân đích không!

 

[ndchung]

Có nhiều yếu tố tác động khiến bạn không thể thành công trong việc câu gene mong muốn. Có thể do điều kiện PCR, do nhiệt độ ở giai đoạn gắn mồi không phù hợp với nhiệt độ yêu cầu của mồi khiến nó gắn vào một đoạn khác. Có thể là...
Trong trường hợp này mình thường thay đổi các chỉ số nồng độ các chất trong phản ứng PCR, giảm nhiệt độ annealing.
Chúc bạn thành công.

 

[langtu_ibt]

Hiện tại thì em đang có 1 đoạn gene cần câu ra.
Vấn đề là khi thiết kế mồi dựa trên trình tự đã biết (e gửi sang Hàn giải trình tự ), thì chỉ câu ra được một phần của đoạn gene đó. Vì vậy chỉ phục vụ được mục đích định tính (tìm xem có gene tương tự trong các chủng khác không).
Em xin hỏi bản chất của việc không amplify được hết cả đoạn gene là gì ạ?
Và hướng khắc phục chung và riêng (nếu có thể) của hiện tượng này.

Em xin cảm ơn!

P/s: e đặt câu hỏi này với mục đích để hiểu rõ hơn về cơ chế và bản chất sinh học, mong các tiền bối không "vặn" ngược lại em và yêu cầu em post gene cụ thể lên thì mới giải quyết được.

=> a nghĩ điều quan trọng là e đã gửi đi để giải trình tự mà chỉ đọc được 1 phần đúng ko? Vấn đề chưa chắc đã phải là hoàn toàn do thiết kế mồi đâu (nhưng cũng là 1 phần ảnh hưởng- mình loại bỏ yếu tố này bằng cách đưa cho bên hãng chuyên thiết kế ). Tuy nhiên, 1 yếu tố có thể gặp phải là trong quá trình giải trình tự, với đoạn lặp Poly C dài, cỡ khoảng chục nu, thì khả năng nhiều máy giải trình tự không làm được, dẫn đến đoạn sau Poly C này hầu như không có tín hiệu.
Việc này có thể giải quyết bằng Pyrosequencing => khá đắt.
Giải quyết bằng Sanger 1 cách có kinh nghiệm sẽ làm được.