HELP ME!!! quý thầy cô cùng các bạn giúp mình câu hỏi này với ạ

[ilovebiotech]

TRÌNH BÀY CÁC BƯỚC SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG BACILLLUS SP Ở VIỆT NAM. BIẾT TRÊN GENEBANK CÓ MỘT SỐ TRÌNH TỰ MÃ HÓA PROTEASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI BACILLUS?
​

mọi người có thể định hướng giúp mình được không ạ!
mình xin cảm ơn trước!
​

note: các thầy cô cho em xin lỗi dã xưng "mình" với các thầy cô​

 

[Nguyễn Xuân Trường]

- Từ trình tự trên genebank thiết kế mồi để tổng hợp đoạn ADN mã hóa cho protease. 2 đầu 5' của mồi bổ sung vị trí của 2 enzyme cắt giới hạn để đưa vào vector lựa chọn. Cần xem protease có trình tự dẫn để tiết ra ngoài không, nếu có bạn có 2 lựa chọn khi tinh sạch protein: trong tế bào thì bỏ trình tự dẫn, trong dịch nuôi cấy thì giữ nguyên trình tự dẫn.
- Tách ADN genome của con Bacillus -> PCR -> tinh sạch sản phẩm có kích thước mong muốn.
- Cắt ADN với 2 enzyme giới hạn đã thiết kế trong mồi -> chuyển trực tiếp vào vector biểu hiện (hoặc qua vector nhân dòng để lấy thêm các vị trí cắt của enzyme giới hạn rồi mới chuyển qua vector biểu hiện).
- Biến nạp vector vào chủng vi khuẩn bạn định biểu hiện. Hiện nay có thể biểu hiện bằng Bacillus (nhưng mình không nắm rõ vì chưa đọc về cách biểu hiện này). Vì protease của bạn có nguồn gốc từ bacillus nên biểu hiện trong bacillus sẽ giảm thiểu trường hợp cuộn gập sai. Còn không thì có thể biểu hiện trong e. coli.
- Chuẩn điều kiện biểu hiện: nồng độ chất cảm ứng, thời điểm cảm ứng, thời điểm thu mẫu, nhiệt độ nuôi cấy.
- Chuẩn điều kiện tinh sạch.
- Thử hoạt tính (nếu bạn thu protease trong dịch nuôi cấy thì có thể thử hoạt tính trước xem có hoạt tính không rồi mới tinh sạch).

 

[cham_c7]

TRÌNH BÀY CÁC BƯỚC SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG BACILLLUS SP Ở VIỆT NAM. BIẾT TRÊN GENEBANK CÓ MỘT SỐ TRÌNH TỰ MÃ HÓA PROTEASE CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI BACILLUS?
​

mọi người có thể định hướng giúp mình được không ạ!
mình xin cảm ơn trước!
​

note: các thầy cô cho em xin lỗi dã xưng "mình" với các thầy cô​

Thật đúng vì đây cũng là vấn đề mình đang quan tâm khi làm đề tài.Mình có một số bài báo bằng tiếng Anh về đề tài này mình gửi bạn xem thử.Chịu khó dịch vậy nhé bạn

Pak. J. Bot., 40(5): 2161-2169, 2008.​

INFLUENCE OF CULTURE CONDITIONS ON PRODUCTION​

AND ACTIVITY OF PROTEASE FROM​

BACILLUS SUBTILIS BS1​

​

MUSSARAT SHAHEEN, AAMER ALI SHAH, ABDUL HAMEED, FARIHA HASAN​

​

Department of Microbiology,​

Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan.​

Abstract

Bacillus subtilis BS1 was used in the present study for the production of protease. For protease production optimum pH and temperature were found to be 11 and 50˚C, respectively. Soybean (197PU/mg) and casein (168 PU/mg) proved as the best substrates for the production of enzyme.Maximum production of protease (126 and 121 PU/mg) was shown in 1.5 and 4.5% of Sodium chloride (NaCl) concentration, respectively. Maximum activity was observed at pH 9 at 90ºC, in crude extract, after 20 minutes of incubation. EDTA slightly enhanced proteolytic activity, whereas, Na, K, Ca, Li, Mg, Cu and Fe inhibited the activity of protease. Due to maximum production of protease in the presence of cheaper, low concentrations of substrate and stability at alkaline pH, high temperature and salt-tolerance, these characteristics makes the strain and its enzymes usefull in different industries.

Introduction

Proteases represent the class of enzymes that occupy a pivotal position with respect
to their physiological roles as well as their commercial applications. More than 75% of industrial enzymes are hydrolases. Protein-degrading enzymes constitute about 40% of all enzymes sales (Leisola et al., 2001). They perform both degradative and synthetic functions. A number of eukaryotic and prokaryotic organisms are reported to produce proteolytic enzymes (Sakka et al., 1986). Many different types of extracellular hydrolytic enzymes as well as some non-hydrolytic enzymes (Lipases, α and β-amylases, cellulases, xylanase, penicillinase, invertase, β-glycosidase, cytase, phosphatases, deaminases, urease, asperginase) are produced by microorganisms e.g., Actinoplanes sp., Arthrobacter sp., Aspergillus sp., Bacillus cereus, Bacillus coaglulans, Bacillus subtilis, Candida sp.,Clostridium sp., Lactobacillus sp., Penicillium sp., Pseudomonas sp., Rhizopus sp., Streptococcus sp., Streptomyces sp., (James & David, 1986). The biosynthesis of proteolytic enzymes by microorganisms is not only of scientific but also of great practical importance. Bacillus subtilis produces both neutral and alkaline protease (Dhandapani & Vijayaragavan, 1994). Proteases produced from Bacillus subtilis have wider specificity than that of trypsin and chymotrypsin of animal origin. They are present in a large variety of commercially available enzymes differing in biological source, activity, purity, physical form and characteristics such as pH and temperature optima (Cheetham, 1995). Enzymes are vulnerable to various environmental factors. Their activitymay be significantly diminished or destroyed by a variety of physical or chemical agen resulting in a loss of the functions performed by the enzymes (Pelczar et al., 1986). The present study was aimed to optimize pH, temperature, substrate and salt concentration for maximum production of protease from Bacillus subtilis BS1 and its stability.




MUSSARAT SHAHEEN ET AL., 2162


Materials and Methods

Microorganisms: Bacillus subtilis BS1, used in the present study, was isolated from
sugar scum from Crescent Sugar Mills Ltd., Faisalabad. Cultures were maintained on
Nutrient agar slants. Qualitative test for protease: Proteolytic activity of Bacillus subtilis BS1 was detected on the basis of appearance of clear zones around the bacterial colonies. Luria casein agar (1%) plates were used for this purpose.

Quantitative test for protease: Liquid medium (250ml) containing (g/l): Gelatin, 15;
casein hydrolysate, 0-5; glycerol, 3ml, with pH 8, was used to screen the bacterial strain
for the production of protease. About 250ml medium was poured in two 1000ml
Erlenmeyer flasks, and pH was adjusted by using 0.1N NaOH and 0.1N CH3COOH. The
medium was autoclaved at 121°C, 15psi for 20 minutes. Oven sterilized, 3ml of 20%
glycerol solution was added to the medium aseptically. Bacillus subtilis BS1 was
inoculated in the medium and the flasks were kept in shaking incubator at 37°C with
150rpm. Samples were collected after 24, 48, 72 and 96 hours and centrifuged at 10,
000rpm for 30 minutes at 4°C. Cell free supernatant was used as the crude enzyme for theestimation of enzyme activity.
To check the activity of enzyme in culture supernatant, method of Kunitz (1965) was
used with casein as a substrate. One unit of enzyme activity is defined as that amount of
enzyme which releases a micro mole tyrosine under standard conditions of assay, 45°C,
pH 8.5 and reaction time one hour.

Optimization of culture conditions for production of protease: Different culture
conditions, like pH (5-11), temperature (40, 50, 60 and 70˚C), different substrates
(gelatin, casein, soybean) and salt concentration (0, 1.5, 3.0, 4.5 and 6%), were optimized
for production of protease from Bacillus subtilis BS1. Samples were collected after 24,
48 and 72hrs and centrifuged at 1000rpm for 30 minutes at 4˚C. Supernatant was used as
crude extract. Proteolytic activity was measured under standard assay conditions.

Stability of enzyme in crude enzyme extract: Protease was produced from Bacillus
subtilis BS1 under optimized conditions. After 48 hours of incubation, cell free
supernatant was taken as crude enzymes extract and used for the characterization. The
effect of pH (4-11), temperature (40, 50, 60, 70, 80, 90, 100˚C) and metal ions (20mM
solution of NaCl, KCl, CaCl2, LiCl2, MgSO4, CuSO4, FeCl2, BaCl2 and HgCl2 and
chelating agent EDTA) on the activity of crude enzyme was studied. The crude enzyme
was incubated for 20 minutes and enzyme activity was measured before and after the
treatment under standard assay conditions. Buffers (0.02M) of different pH values were
used: acetate buffer (pH 4, 5), phosphate buffer (6, 7), Tris (pH 8) and glycine-NaOH
buffer (pH 9, 10, 11) for assay.

Results and Discussion

Qualitative and quantitative analysis: Bacillus subtilis BS1, was found to produce
protease on the basis of clear zones around the bacterial colonies on 1% casein agar
PRODUCTION AND ACTIVITY OF PROTEASE FROM BACILLUS SUBTILIS
plates at 37˚C after 24 hours. These clear zones were due to hydrolysis of different
substrates (Khire & Pant, 1992). Maximum production of protease by Bacillus subtilis
BS1 was 131 U/ml after 48hrs, at 37˚C, pH 8 and 150rpm, in Gelatin casein medium. The
production was 129, 123 and 109 U/ml after 24, 72 and 96 hrs, respectively.


Optimization of culture conditions for protease production

Effect of pH:
Production of protease was observed at various pH values ranging from 4 to
11. The maximum production of protease was 523 PU/mg, at pH 11 after 48hrs (Fig. 1).
Kobayashi (1995) reported optimal activity of bacterial protease at pH 11. Cheetham
(1995), Muderrizade et al., (2001) and Kumar (2002) also reported the production of an
alkaline protease at 11.5 from Bacillus sp. The study reveals that the enzyme secretion is
greatly influenced by the change in initial pH of the environment (Sarkar et al., 1998).
Enzymes possess many ionizable groups so that pH changes may alter the conformation of
the enzyme (Cheetham, 1995).

Effect of temperature:
Only few microbial strains are able to grow at elevated temperatures (Cheetham, 1995). Effect of various temperatures, 40, 50, 60 and 70˚C on protease production was studied. It was observed that enzyme production was maximum (301 PU/mg) at 50˚C (Fig. 2). Sookkeo et al., (2000) and Kobayashi (1995) reported production of protease at such high temperatures. Mao & Freedman (1992) found that maximum protease production could be achieved by controlled pH and temperature.

Effect of substrates:
The substrates used in industrial enzyme fermentations are normally common agricultural products like soybean, casein, starch and ordinary sugar (Cheetham, 1995). Enzyme formation is largely dependent on the condition of growth of the culture and composition of nutrient medium (Fujiwara & Masui, 1993). In the present study, casein, gelatin and soybean flour with glycerol and casein hydrolysate were used as substrates for the production of protease from Bacillus subtilis BS1, at pH 11. Maximum production of protease (197 PU/mg) was observed in case of soybean after 48 hrs of incubation while in case of casein and gelatin, the production of protease was found as 171 PU/mg and 163 PU/mg, respectively after 72 hrs of incubation. Sun (1997) reported maximum production of protease from B. sphaericus C3-41 in the presence of soybean after 48 hrs of incubation. Geoffrey & Hodges (1981) found that protease synthesis occurred at exponential phase of bacterial growth, which is associated with sporulation of B. subtilis, but according to Dercova et al., (1992), the secretions of enzyme occurs mostly between the end of the exponential phase to an early stationary phase, maximum production occurs after cell population reached its peak. High levels of proteases were produced on casein, soybean flour and starch (Mahmood et al., 2000; Sampath &Chandrakasan, 1998). Gelatin and soybean act as organic nitrogen sources and enhance the bacterial growth, while casein hydrolysate is a source of readymade amino
acids and encourage the foam formation to remove spores and cellular debris from the
culture medium (Feng et al., 2001). It also enhances the extracellular alkaline protease
synthesis. The above results showed that enzyme production was mostly decreased after
48hrs., this might be due to the depletion of nitrogen and other sources present in
medium, which were utilized by the organisms, or due to inactivation of enzyme by
acidification of the medium (Dervoca et al., 1992).














Effect of NaCl: In the present study, various salt concentrations from (0-6%) were used
to study the effect of NaCl on the production of protease from Bacillus subtilis BS1.
Maximum enzyme (126 PU/mg) was produced in the presence of 1.5% NaCl (Fig. 4),
followed by 4.5 and 3%. Tolerance of enzyme up to 5 M of NaCl over 24hrs without
losing original activity was reported by Jana et al., (1997).

Stability of protease in crude enzyme extract: Both low and high levels of temperature
and pH affect the enzyme activity and stability.

Effect of pH: The enzyme activity of the protease produced by Bacillus subtilis BS1 was
determined after incubating the crude extract for 20 minutes at 90˚C at different pH
values. The enzyme showed maximum activity (100%) at pH 9. It was shown that the
enzyme was 96 % stable at pH 6 and 89% stable at pH 10 and 11 (Fig. 5). Protease
activities at alkaline pH (8-11) were studied by Kim et al., (2001) and Feng et al., (2001).

Effect of temperature:
The effect of temperature on the activity of enzyme was studied. Maximum activity was shown at 90˚C and 50˚C, 100% and 97%, respectively (Fig. 6). Activity of protease at 45˚C for 30min., and 80˚C for 10min., and 60min., respectively was reported by Feng et al., (2001). The decrease in enzyme activity at higher temperatures might be due to the destruction of an enzyme at certain temperatures.

Effect of metal ions:
Metal ions often act as salt or ion bridges between two adjacent amino acid residues. Effects of various metal ions are shown in Fig. 7. K, Li+2, Mg+2, Cu+2, Na inhibited the activity of protease, but EDTA played important role in stimulation of enzyme activity and increased the activity up to 101%. Observations aboutMUSSARAT SHAHEEN ET AL., 2168
the stability of enzyme in the presence of EDTA are also reported by Muderrizade et al.,
(2001). Inhibition by EDTA, Hg, Fe, Cu, Fe, Mg and Li was also reported by Sun et al.,
(1997) and Sookkeo et al., (2000). In the present work, strong inhibition or stimulation by
metal ions in case of protease activity, was not observed. Alkaline proteases are generally
neither inhibited by metal chelating reagents nor activated by metal ions or reducing
agents (Kim et al., 2001).

 

[ilovebiotech]

cho mjnh cam on nhe! thanks

mjnh moi la thanh vien nen ko biet noi gj ca. cam on sinhhocvietnam.com/forum

thanks!

 

[dacnhiem294]

bạn ơi! mục này đâu phải để tán gẫu đâu??? mà bạn dùng vietkey viết tiếng việt có dấu nha!!! kẻo bị del bài đó!

 

[cham_c7]

Mình mới tìm thấy bài dịch của bài báo trên nhưng không đầy đủ lắm up lên để bạn tham khảo




Pak. J. Bot, 40 (5):. 2161-2169, năm 2008.
ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN SẢN XUẤT
VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME PROTEASE TỪ
Bacillus subtilis BS1

MUSSARAT Shaheen, AAMER ALI SHAH, Abdul Hameed, FARIHA Hasan

Bộ Vi sinh vật,
Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan.

Tóm tắt

BS1 Bacillus subtilis đã được sử dụng trong nghiên cứu này để sản xuất protease. Đối với sản xuất protease pH tối ưu và nhiệt độ đã được tìm thấy tương ứng là 11 và 50 藲 C. Đã chứng minh Đậu tương (197PU/mg) và casein (168 PU / mg) là chất nền tốt nhất cho việc sản xuất các enzyme. Sản xuất protease tối đa (126 và 121pu/mg) tương ứng với nồng độ NaCl là 1,5% và 4,5%. Hoạt động tối đa được quan sát ở pH 9 tại 90 độ C, ở dạng thô xuất, sau 20 phút của ủ bệnh. EDTA tăng cường hoạt động phân giải protein, trong khi đó, Na, K, Ca, Li, Mg, Cu, Fe ức chế hoạt động của protease. Do sản xuất protease tối đa trong nồng độ thấp của chất nền và sự ổn định ở pH kiềm, nhiệt độ cao và chịu- muối là rẻ hơn, đặc điểm này làm cho chủng Bacillus subtilis và enzyme của nó hữu ích trong các ngành công nghiệp khác nhau.

Giới thiệu

Protease đại diện cho các chủng enzyme, chiếm một vị trí quan trọng đối với
với vai trò sinh lý của chúng cũng như các ứng dụng thương mại. Hơn 75% các enzyme công nghiệp là hydrolases. enzyme phân hủy protein chiếm khoảng 40% tổng doanh số bán enzyme được bán (Leisola et al, 2001.). Chúng thực hiện cả hai chức năng phân hủy và tổng hợp Một số sinh vật nhân chuẩn và nhân sơ được sử dụng để sản xuất các enzym thủy phân protein (Sakka et al., 1986).. Nhiều loại khác nhau của các enzym thủy phân ngoại bào cũng như một số enzym thủy phân không bào (lipases, α và β-amylases, cellulase, xylanase, penicillinase, invertase, β-glycosidaza, cytase, phosphatases, deaminases, urease, asperginase) được sản xuất bởi các vi sinh vật ví dụ, Actinoplanes sp, Arthrobacter sp, Aspergillus sp, Bacillus cereus, coaglulans Bacillus, Bacillus subtilis, Candida sp, Clostridium sp, Lactobacillus sp, Penicillium sp, Pseudomonas sp, Rhizopus sp, Streptococcus sp, Streptomyces sp, (James & David, 1986).
. Sinh tổng hợp các enzym thủy phân protein của vi sinh vật không chỉ ứng dụng trong khoa học mà còn có tầm quan trọng rất lớn trong thực tế .vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tạo ra cả hai protease trung tính và kiềm (Dhandapani & Vijayaragavan, 1994).. Protease sản xuất từ Bacillus subtilis có đặc trưng hơn so với trypsin và chymotrypsin nguồn gốc động vật. Chúng có trong một lượng lớn các enzim thương mại khác nhau trong nguồn sinh học, hoạt động, độ tinh khiết, hình thức vật lý và đặc điểm như độ pH và nhiệt độ Optima (Cheetham, 1995) . các yếu tố môi trường khác nhau sẽ gây tổn thương đến enzyme. Hoạt động của chúng có thể bị giảm đáng kể hoặc bị phá hủy bởi một loạt các Agen vật lý, hóa học dẫn đến mất chức năng hoạt đông (Pelczar et al., 1986). Các nghiên cứu dưới đây nhằm mục đích tối ưu hóa độ pH, nhiệt độ bề mặt, và nồng độ muối cho sản xuất lượng lớn protease từ Bacillus subtilis BS1 và sự ổn định của nó.



Shaheen MUSSARAT ET AL., 2162


Vật liệu và phương pháp

Vi sinh vật: Bacillus subtilis BS1, sử dụng trong nghiên cứu này, được phân lập từ
cặn bã đường Crescent Mills Ltd, Faisalabad. Nền môi trường được duy trì trên
Dinh dưỡng thạch nghiêng. Thử cho protease: phân giải protein hoạt động của BS1 Bacillus subtilis đã được phát hiện trên cơ sở sự xuất hiện của khu rõ ràng xung quanh vi khuẩn. Luria casein agar (1%) tấm được sử dụng cho mục đích này.

Định lượng kiểm tra cho protease: Liquid trung bình (250ml) có chứa (g / l): Gelatin 15; casein thủy phân 0-5; glycerol 3ml, với độ pH 8, đã được sử dụng để sản xuất protease. 250ml dung dịch đã được đổ vào hai bình Erlenmeyer 1000ml, và độ pH đã được điều chỉnh bằng cách sử dụng 0.1N NaOH và CH3COOH 0.1N. Các bình được hấp ở 121 [FONT=&quot]0[/FONT]C, 15psi trong 20 phút. Lò khử trùng, 3ml glycerol 20% giải phá đã được thêm vào môi trường vô trùng. Bacillus subtilis BS1 cấy trong môi trường và các bình được giữ trong lồng ấp lắc ở 37 掳 C với 150rpm. Các mẫu được thu thập sau khi giờ 24, 48, 72 và 96 và ly tâm ở 10, 000rpm trong 30 phút ở 4 [FONT=&quot]0[/FONT]C. Tế bào nổi trên bề mặt được sử dụng như các enzyme thô để nghiên cứu các hoạt động của enzym.
Để kiểm tra hoạt động của các enzyme trong b ề mặt môi trường, phương pháp Kunitz (1965) đã được được sử dụng với casein là chất nền. Một đơn vị hoạt động enzyme được định nghĩa là tổng số enzym giải phóng một tyrosine vi nốt ruồi trong điều kiện tiêu chuẩn của khảo nghiệm, 45 [FONT=&quot]0 [/FONT]C, pH 8,5 và thời gian phản ứng một giờ.

Tối ưu hóa các điều kiện môi trường để sản xuất protease: môi trường khác nhau
điều kiện, như độ pH (11/05), nhiệt độ (40, 50, 60 và 70 藲 C), các chất nền khác nhau
(Gelatin, casein, đậu tương) và nồng độ muối (0, 1,5, 3,0, 4,5 và 6%), đã được tối ưu hóa sản xuất protease từ Bacillus subtilis BS1. Các mẫu được thu thập sau 24,
48, 72 giờ và ly tâm ở 1000rpm trong 30 phút ở 4 藲 C. Gạn được sử dụng như trích xuất thô. Hoạt động phân giải protein được đo trong điều kiện khảo nghiệm tiêu chuẩn.

Tính ổn định của enzyme trong chiết enzyme thô: Protease được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis BS1 trong điều kiện tối ưu hóa. Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào gạn được dùng như các enzyme thô và sử dụng để mô tả đặc điểm này. Các ảnh hưởng của độ pH (11/04), nhiệt độ (40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 藲 C) và các ion kim loại (20mm dung dịch NaCl, KCl, CaCl2, LiCl2, MgSO4, CuSO 4, FeCl2, BaCl2 và HgCl2 và EDTA) về hoạt động của các enzyme thô đã được nghiên cứu. Các enzyme thô được ủ trong 20 phút và hoạt động của enzyme được đo trước và sau khi ủ trong điều kiện khảo nghiệm tiêu chuẩn. Bộ đệm (0.02M) của các giá trị pH khác nhau được được sử dụng: acetate bộ đệm (4 pH, 5), phosphate buffer (6, 7), Tris (pH 8) và NaOH glycine bộ đệm (9 pH, 10, 11) để khảo nghiệm.



Kết quả và Thảo luận

Phân tích chất lượng và định lượng: Bacillus subtilis BS1,rõ ràng đã được tìm thấy để sản xuất protease trên các khu xung quanh các khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường thạch casein 1%. Hoạt động sản xuất enzyme protease từ Bacillus subtilis ở 37 0 C sau 24 giờ. Các khu vực này nhận ra rõ ràng là docó sự thủy phân chất nền khác nhau (Khire & Pant, 1992). Sản xuất protease tối đa do Bacillus subtilis BS1 là 131 U / ml sau 48 giờ, ở 37 藲 C, pH 8 và 150rpm, trong môi trường casein Gelatin. Các sản xuất được 129, 123 và U 109 / ml tương ứng sau 24, 72 và 96 giờ.


Tối ưu hóa các điều kiện văn hóa để sản xuất protease

Ảnh hưởng của pH:
Sản xuất protease đã được quan sát tại các giá trị pH khác nhau, từ 4 đến
11. Việc sản xuất protease tối đa là 523 PU / mg, ở pH 11 sau 48hrs (Hình 1).
Kobayashi (1995) báo cáo hoạt động tối ưu của protease vi khuẩn ở pH 11. Cheetham (1995), Muderrizade et al., (2001) và Kumar (2002) cũng thông báo việc sản xuất của một protease kiềm 11,5 từ Bacillus sp. Nghiên cứu cho thấy rằng sự tiết enzyme chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi sự thay đổi pH ban đầu của môi trường (Sarkar và cộng sự, 1998.). Enzym có nhiều nhóm ionizable để thay đổi độ pH có thể thay đổi hình dáng của các enzyme (Cheetham, 1995).

Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Chỉ có vài chủng vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ cao (Cheetham, 1995). Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau, 40, 50, 60 và C 藲 70 về sản xuất protease đã được nghiên cứu. Các nghiên cứu đã quan sát thấy rằng enzyme sản xuất được tối đa (301 PU / mg) tại 50 [FONT=&quot]0[/FONT] C (Hình 2). Sookkeo et al., (2000) và Kobayashi (1995) báo cáo sản xuất của protease ở nhiệt độ cao. Mao & Freedman (1992) thấy rằng sản xuất protease tối đa có thể đạt được bằng cách kiểm soát độ pH và nhiệt độ
Ảnh hưởng của chất:
Các chất được sử dụng trong công nghiệp lên men enzyme thường là các sản phẩm nông nghiệp phổ biến như đậu tương, tinh bột, casein và đường thông thường (Cheetham, 1995). Enzyme hình thành phần lớn phụ thuộc vào điều kiện của sự tăng trưởng của nền môi trường và thành phần của môi trường dinh dưỡng (Fujiwara & Masui, 1993). Trong nghiên cứu này, casein, gelatin và bột đậu tương với glycerol và thủy phân casein được sử dụng làm chất nền cho việc sản xuất protease từ Bacillus subtilis BS1, ở pH 11. Sản xuất tối đa của protease (197 PU / mg) đã được quan sát trong trường hợp đậu tương sau 48 giờ ủ bệnh trong khi trong trường hợp của casein và gelatin, việc sản xuất các protease đã được tìm thấy là 171 PU / mg và PU 163 / mg, tương ứng sau 72 giờ ủ. Sun (1997) báo cáo sản xuất tối đa của protease từ B. sphaericus C3-41 với sự hiện diện của đậu tương sau 48 giờ ủ. Geoffrey & Hodges (1981) thấy rằng protease tổng hợp xảy ra ở giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân của vi khuẩn, được kết hợp với hình thành bào tử của B. subtilis, nhưng theo Dercova et al., (1992), các tiết các men tiêu hóa xảy ra chủ yếu giữa cuối giai đoạn theo cấp số nhân cho một giai đoạn văn phòng phẩm đầu, sản xuất tối đa xảy ra sau khi di dân lên tới đỉnh điểm. cấp cao của protease đã được sản xuất trên casein, bột đậu tương và tinh bột (Mahmood và cộng sự, 2000;. Sampath & Chandrakasan, 1998). Gelatin và đậu nành làm nguồn nitơ hữu cơ và tăng cường sự phát triển của vi khuẩn, trong khi casein thủy phân là một nguồn readymade amin
axit và khuyến khích sự hình thành bọt để loại bỏ các bào tử và các mảnh vỡ tế bào từ
văn hóa trung bình (Feng và cộng sự, 2001.). Nó cũng tăng cường các protease kiềm ngoại bào
tổng hợp. Kết quả trên cho thấy, sản xuất enzyme đã được chủ yếu là giảm sau khi
48hrs., Điều này có thể là do sự suy giảm của nitơ và các nguồn khác hiện diện trong
trung bình, được sử dụng bởi các sinh vật, hoặc do sự bất hoạt enzyme do
axit hóa của môi trường (Dervoca et al, 1992.).














Ảnh hưởng của NaCl: Trong nghiên cứu này, nồng độ muối khác nhau từ (0-6%) được sử dụng
nghiên cứu tác động của NaCl về sản xuất protease từ Bacillus subtilis BS1.
Tối đa enzyme (126 PU / mg) được sản xuất với sự có mặt của NaCl 1,5% (Hình 4),
tiếp theo là 4,5 và 3%. Khoan dung với những enzyme lên đến 5 M của NaCl trong 24 giờ mỗi ngày mà không cần
mất hoạt động ban đầu đã được báo cáo của Jana et al., (1997).

Tính ổn định của protease trong chiết enzyme thô: Cả hai mức độ thấp và nhiệt độ cao
và pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym và ổn định.

Ảnh hưởng của pH: Các hoạt động enzyme của protease do Bacillus subtilis là BS1
xác định sau khi ấp các chiết xuất dầu thô trong 20 phút ở 90 藲 C ở độ pH khác nhau
giá trị. Các enzyme cho thấy hoạt động tối đa (100%) ở pH 9. Nó đã được chỉ ra rằng
enzyme được 96% ổn định ở pH 6 và 89% ổn định ở pH 10 và 11 (Hình 5). Protease
hoạt động ở pH kiềm (11/08) đã được nghiên cứu bởi Kim et al., (2001) và Phong et al., (2001).

Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Ảnh hưởng của nhiệt độ hoạt động của enzyme đã được nghiên cứu. hoạt động tối đa được hiển thị ở 90 藲 C và 50 藲 C, 100% và 97%, tương ứng (Hình 6). Hoạt động của protease ở 45 藲 C cho 30 phút, và. 80 C 藲 cho 10min., Và 60min., Tương ứng đã được báo cáo của Phong et al., (2001). Sự giảm hoạt động của enzyme ở nhiệt độ cao có thể là do sự tàn phá của một loại enzyme ở nhiệt độ nhất định.

Ảnh hưởng của các ion kim loại:
Các ion kim loại thường hành động như cầu muối hoặc ion giữa hai dư lượng acid amin liền kề. Ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau được thể hiện trong hình. 7. K, +2 Li, Mg +2, Cu +2, Na ức chế hoạt động của protease, nhưng EDTA đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích hoạt động của enzyme và làm tăng hoạt động lên đến 101%. Các quan sát aboutMUSSARAT Shaheen ET AL, 2168.
sự ổn định của các enzyme trong sự hiện diện của EDTA cũng được báo cáo của al Muderrizade và cộng sự.,
(2001). Sự ức chế bởi EDTA, Hg, Fe, Cu, Fe, Mg và Li cũng đã được báo cáo của CN et al.,
(1997) và Sookkeo et al., (2000). Trong công việc hiện tại, sự ức chế hoặc kích thích mạnh bởi
các ion kim loại trong trường hợp hoạt động protease, đã không được quan sát thấy. Protease kiềm thường
không bị ức chế bởi chất thử kim loại chelating cũng không kích hoạt bởi các ion kim loại, giảm
đại lý (Kim và cộng sự, 2001.).