Giới thiệu về kỹ thuật MassTag PCR

Cùng với sự phát triển chóng mặt của khoa học kỹ thuật, các phương thức mới để thực hiện PCR liên tục được đưa ra nhằm cải thiện hiệu suất, hiệu quả cũng như tính đặc hiệu so với PCR truyền thống.

Như chúng ta đã biết, mục đích chính của PCR là khuếch đại một chuỗi nucleic acid dựa trên trình tự mồi đặc hiệu (sequence-specific primers). Vì nhu cầu sử dụng cũng như tính ứng dụng thiết yếu của kỹ thuật này mà càng nhiều dạng biến thể của PCR được tạo ra, ví dụ, qPCR, RACE-PCR, Digital PCR, Multiplex PCR, MassTag PCR.

Trong phần này, chúng ta sẽ cùng nhau tìm hiểu về MassTag PCR và làm thế nào để sử dụng nó trong thực nghiệm.

Kỹ thuật MassTag PCR là gì?

MassTag PCR là một dạng của PCR đa mồi (multiplex PCR) sử dụng phép đo khối phổ (mass spectrometry) để phân biệt sản phẩm PCR. Tóm lại, PCR đa mồi cho phép ta phát hiện đồng thời nhiều gen mục tiêu chỉ trong 1 phản ứng PCR. Kỹ thuật MassTag PCR đặc biệt hữu ích khi lượng mẫu hạn chế và khi cần sự chính xác cao trong định lượng. Với việc sử dụng biến thể này, ta sẽ tránh được những lỗi tương tự như trong qPCR tiêu chuẩn (standard qPCR) mà lại có sự đa dạng trong các giếng phản ứng.

Đa mồi với MassTag PCR

Trong MassTag PCR, sự hiện diện của mỗi tag đặc thù (ví dụ, MassTag) trên mỗi sản phẩm PCR đóng vai trò như 1 mã vạch (barcode) cho phần DNA cụ thể được khuếch đại (specific amplicon). Bên cạnh đó, kỹ thuật khối phổ sẽ tách biệt và đếm những mã vạch đó sau khi quy trình PCR kết thúc.

Đặc biệt, MassTag PCR có thể phân biệt sản phẩm PCR chỉ bởi 1 nucleotide khác nhau duy nhất. Đơn giản bởi ở đó không có giới hạn (về mặt lý thuyết) trong việc có bao nhiêu sản phẩm được phân loại bằng kỹ thuật khối phổ, ta có thể khảo sát lượng lớn gene đích chỉ trong 1 phản ứng PCR. Điều này có ý nghĩa rất lớn khi số lượng mẫu hạn chế, như đã đề cập ở phần trên, ví dụ, trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm và an toàn thực phẩm (kiểm tra sự nhiễm khuẩn trong thực phẩm).

MassTag PCR sử dụng mồi đánh dấu (labelled or tagged primers)

Để đánh dấu sản phẩm PCR với MassTag đặc hiệu, ta có thể sử dụng mồi đã biến đổi ở đầu 5’ với các nucleotide kéo dài hoặc các sản phẩm thương mại của MassTag PCR. Ví dụ, vùng 5’ có thể bị thay đổi (modified) nhờ đó mỗi cặp mồi sẽ chứa một đoạn lặp lại của T – Thymidine (Ts) dẫn tới sự khác biệt về khối lượng, với mỗi đoạn Ts có số lượng T khác nhau.

Xử lý các bước hậu PCR

Sau khi kết thúc 1 phản ứng MassTag PCR, sản phẩm sẽ được xử lý với shrimp alkaline phosphatase (SAP) và exonuclease1 để loại bỏ nucleotides và mồi thừa. Bên cạnh đó, tia UV cũng có khả năng tách MassTag thương mại từ sản phẩm PCR của quá trình này, dọn đường cho việc áp dụng kỹ thuật khối phổ. Một điều đáng lưu tâm là bạn sẽ nhận được kết quả định lượng khối phổ (quantitative mass spectrometric data) ở nơi mà các đỉnh khác nhau đáp ứng với những mã vạch đặc hiệu hoặc MassTags (Hình 1).

Hình 1. Lược đồ từ kết quả của một phản ứng PCR đa mồi điển hình. Ở đây, việc tổng hợp cDNA và thực hiện MassTag PCR từ RNA từ 5 mẫu bệnh phẩm đã biết chứa tác nhân gây bệnh (viral pathogens) sử dụng mồi đánh dấu (labelled primers). Chiều cao của cột biểu thị số lượng lớn của MassTag ấy (mã vạch) tương ứng với Virus X hoặc Virus Y. Đường đứt gãy thể hiện một giá trị đã cắt giảm tùy ý (arbitrary cut-off value) phản ảnh tín hiệu trung bình thu nhận được cùng đối chứng DNA người. Ở thí nghiệm này, bệnh nhân số 2 cho kết quả dương tính với Virus X, trong khi bệnh nhân 1 dương tính với Virus Y. Trong thực tế, một lượng lớn các loại virus có thể được xác định đồng thời chỉ với 1 lượng mẫu khiêm tốn.

Làm thế nào để so sánh MassTag PCR với PCR quy chuẩn?

Lợi thế

MassTag PCR có độ nhạy cao và có khả năng phát hiện nhiều amplicon hơn PCR đa mồi thông thường rất nhiều. Thử tưởng tượng với 64 loại mẫu đã được đánh dấu khác nhau, vậy ta có thể kiểm tra một lượng lớn vi khuẩn gây bệnh chỉ trong 1 lần! Hoặc thậm chí là thu thập thêm dữ liệu từ những mẫu có nồng độ cực thấp như sinh thiết.

Cần nhấn mạnh rằng, kỹ thuật khối phổ có thể phát hiện sự khác biệt dù là rất nhỏ ở kích thước cho phép ta tự tin phân tích các chuỗi gần giống nhau.

Việc cài đặt (set-up) thí nghiệm này tương tự với PCR tiêu chuẩn. Ví dụ, ta có thể sử dụng bất kỳ máy PCR quy chuẩn nào với mồi đặc hiệu để chạy MassTag PCR.

Một vài ưu điểm khác chính là việc không còn phải đương đầu với các điện cực trên máy chạy gel, hoặc loay hoay với mảng bám DNA độc hại. Và hơn nữa, không còn việc đoán kích thước băng DNA, thay vào đó, phương pháp PCR này cho ta một bức tranh rõ nét khi có sự hiện diện của các MassTag đặc hiệu.

Bất lợi

Tốn kém thời gian và tiền bạc trong việc thiết kế mồi chuyên dụng (specialized primers).

Yêu cầu máy đo khối phổ và người nắm vững cách sử dụng máy, đặc biệt khi chiếc máy này vẫn còn tương đối xa lạ với các nhà sinh học. Bởi lẽ đó, ta cần phải nắm bắt cách sử dụng và bổ sung kiến thức nền về kỹ thuật này.

Sự hữu ích của MassTag PCR

Điểm nhấn của kỹ thuật này chính là khả năng thao tác đa mồi và độ chính xác cao. Đến thời điểm hiện tại, nó đã chứng minh được khả năng đáng kinh ngạc trong chẩn đoán y học. MassTag PCR còn thể hiện một ví dụ ấn tượng khác về sự kết hợp giữa sinh học và quang phổ khối lượng.

Rất có thể sự phổ thông của MassTag PCR bị hạn chế vì việc đòi hỏi sự trợ giúp của phương pháp khối phổ, tuy vậy đến một thời điểm mà thiết bị liên quan không còn là trở ngại thì phương pháp PCR kể trên sẽ thực sự được nhân rộng và cho thấy sự thiết yếu của nó.

Tài liệu tham khảo

  1. Haff LA, Smirnov IP. (1997) Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Res. 25(18):3749-50. doi:10.1093/nar/25.18.3749.
  2. Briese T, Palacios G, Kokoris M, Jabado O, Liu Z, Renwick N, et al. (2005) Diagnostic system for rapid and sensitive differential detection of pathogens. Emerg Infect Dis. 11(2):310-3. doi:10.3201/eid1102.040492.

Đọc thêm


Nguồn gốc bài viết: Bitesizebio

Người dịch: Vũ Hải Sơn

Biên tập: Sinhhocvietnam.com

SHARE