Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Phòng thí nghiệm > Làm thí nghiệm với protein


 
Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 27-07-05, 20:38   #1
Trương Quốc Phong
Registered Users
 
Trương Quốc Phong's Avatar
 
Tham gia ngày: May 2005
Đến từ: Khoa Hóa sinh và SHPT, ĐH Bách khoa HN
Bài gửi: 21
Thanks: 0
Thanked 3 Times in 3 Posts
Theo kinh nghiem cua toi de co mot ban dien di 1D-gel dep can chu y:
1. Chuan bi mau tot : protein phai tan hoan toan, bien tinh hoan toan (dien di bien tinh), nong do cac chat gay nhot phai thap den muc co the,....
2. Do (duc) gel polyacrylamide o nong do thich hop voi protein trong mau cua minh (thong thuong 10 - 12,5% la rat tot doi voi mau la dich chiet tho (crude extract) Dong vat).
3. Chu y den %C trong dung dich acrylamide.
4. Khi do gel chu y den luong APS va TEMED: sau khoang 30 phut bat dau thay su trung hop la duoc
5. Khong nen do ca gel Co (stacking gel) va gel Tach (separating gel) roi de qua dem ma neu muon de qua dem thi chi do Gel tach, khi nao chay thi se do gel Co.
6. Dieu kien chay: Tuy tung doi tuong cu the ma cac ban co the Setup chuong trinh chay khac nhau, tuy nhien thong thuong doi voi 1D gel thi: co dinh mA ( cung co the co dinh Voltage): 1-1.5 mA cho mot gieng dien di. Chu y hieu dien the neu no tang qua 150 V thi phai giam mA xuong. Nen chay o khoang 50 V cho den khi vach mau cua Bromphenol Blue ra khoi gel co, sau do tang len nhu tren.
7. De tranh smearing, va bang protein khong deu nen rua gieng truoc khi Load mau bang cach dung Pipet Halmiton hoac dau tip 100 ul cung duoc.
Thuc te con nhieu dieu luu y khac nhung no khong phai la co ban lam nen toi khong dua ra.
Con cach pha hoa chat thi cac ban co the xem trong cuon Hoefer, day la cuon sach co ban nhat ve dien di protein hoac cuon Electrophoresis in Practice.
( Cac ban co the xem anh dien di cua toi thuong lam voi nhung dieu luu y nay va cho biet the da duoc chua nhe) Cam on.
(Theo nhan xet cua toi thi trong nhung dieu tren dieu quan trong nhat la phai co mau tot)


Ảnh điện di protein trên SDS-PAGE gel 12.5%
Trương Quốc Phong is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 09-09-05, 06:42   #2
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,133
Thanks: 156
Thanked 705 Times in 418 Posts
Xin hỏi bạn thường dùng extraction buffer là gì? Theo bạn dùng extraction buffer nào vừa hiệu quả vừa rẻ tiền?
Tôi chỉ có urea, tris, SDS, NaCl, HCl: có làm được extracting cocktail tốt không?
Có người dùng nước cất, PBS, dd NaCl, ddNaOH để làm extracting buffer. Tôi thấy hơi quái vì chẳng thấy lysis reagent chỗ nào? (chẳng lẽ chỉ nghiền mẫu không là đủ) Nhưng kiến thức hơi cạn không phản bác được. Anh em xin cho ý kiến.
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 12-09-05, 00:21   #3
Trương Quốc Phong
Registered Users
Thread starter
 
Trương Quốc Phong's Avatar
 
Tham gia ngày: May 2005
Đến từ: Khoa Hóa sinh và SHPT, ĐH Bách khoa HN
Bài gửi: 21
Thanks: 0
Thanked 3 Times in 3 Posts
Đối với mỗi một đối tượng nghiên cứu, mỗi một mục đích nghiên cứu, và ta sẽ làm gì với mẫu của mình thì sẽ phải dùng các phương pháp khác nhau cũng như chọn các buffer khau.
Ví dụ :
- Bạn muốn tách cytosolic proteins, hay plasma membrane proteins, hay nuclear membrane proteins, .... bạn sẽ phải chọn các đệm khác nhau. Vì sao? vì các tính chất của các proteins ở các vị trí này không hoàn toàn giống nhau.
- Bạn sẽ định làm gì tiếp với mẫu protein thu đựợc? bạn cũng sẽ phải chọn các đệm khác nhau mặc dù bạn đều muốn tách cytosolic proteins. Tại sao như vậy? Tại vì mỗi một phương pháp bạn sử dụng sau đó nó chỉ làm việc trong một điều kiện riêng.Ví dụ bạn dùng mẫu protein để điện di 1D gel khác, 2D gel khac, LC khác, NanoLC khác, PF2D khác,...
Trong nghiên cứu, bạn biết rồi đấy làm sao chọn được phương pháp nào càng đơn giản và càng rẻ tiền càng tốt. Nhưng điều đó không phải lúc nào cũng đúng và không phải trong trường hợp nào cũng áp dụng được. Có những nghiên cứu đòi hỏi bạn phải chấp nhận với những hóa chất đắt tiền.
Trong tay bạn chỉ có urea, tris, SDS, NaCl, HCl bạn vẫn có thể tách chiết đựợc protein nhưng là protein ở đâu trong tế bào (như tôi đã đề cập ở trên) mặc dù bạn không thấy có detergents. Bằng chứng thực tế là trong ảnh mà tôi đã post lên cho các bạn đó, tôi chỉ dùng có mỗi đệm PBS thông thuờng, mà các bạn biết không tôi cũng đã thu được cả protein bám màng đó (Troponin I). Tất nhiên, quy trình tách thì biến đổi đi một chút.
Chúc bạn may mắn.
Trương Quốc Phong is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 12-09-05, 09:08   #4
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,133
Thanks: 156
Thanked 705 Times in 418 Posts
Nhưng bạn có máy nghiền mẫu (homogenizer) phải không? Nếu nghiền bằng tay mà dùng đệm PBS thì hàm lượng protein thu được rất thấp. Hoặc nếu nghiền mà không có Nitơ lỏng nữa thì càng ít protein.
Mà cái hinh điện di của bạn cho thấy mẫu đã qua tinh sạch rồi, phải không?
Protein nói chung sau khi được sản xuất đều được đóng gói (dù xuất ra ngoài hay giữ lại trong tế bào), do đó nếu không có detergents để lyze màng thì mấy protein thu được chỉ đại diện cho một phần protein nhỏ của tế bào thôi. Vì vậy nếu nói dùng nước cất, dùng đệm NaCl, dùng HCl hoặc NaOH để "chiết" protein thì e không đúng. Mấy cái này chỉ là dung môi hòa tan một số protein thôi.
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 12-09-05, 12:17   #5
Nguyễn Phương Thảo
Registered Users
 
Nguyễn Phương Thảo's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2005
Đến từ: Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện CNSH, VAST
Bài gửi: 27
Thanks: 0
Thanked 1 Time in 1 Post
Trích:
Nguyên văn bởi Drosophilia
Nhưng bạn có máy nghiền mẫu (homogenizer) phải không? Nếu nghiền bằng tay mà dùng đệm PBS thì hàm lượng protein thu được rất thấp. Hoặc nếu nghiền mà không có Nitơ lỏng nữa thì càng ít protein.
Mà cái hinh điện di của bạn cho thấy mẫu đã qua tinh sạch rồi, phải không?
Protein nói chung sau khi được sản xuất đều được đóng gói (dù xuất ra ngoài hay giữ lại trong tế bào), do đó nếu không có detergents để lyze màng thì mấy protein thu được chỉ đại diện cho một phần protein nhỏ của tế bào thôi. Vì vậy nếu nói dùng nước cất, dùng đệm NaCl, dùng HCl hoặc NaOH để "chiết" protein thì e không đúng. Mấy cái này chỉ là dung môi hòa tan một số protein thôi.
Có mấy ý bạn nói không chính xác. Tôi có máy nghiền mẫu nhưng vẫn thường chọn cách nghiền bằng tay, hàm lượng protein thu được không phụ thuộc nhiều vào việc này.

Tùy vào trường hợp cụ thể, tuy nhiên nếu tách chiết protein từ suspension cultured cells, tôi thường không sử dụng nitơ lỏng, cũng không thấy có ảnh hưởng gì nhiều đến hàm lượng protein thu được.

Để có chất lượng điện di tương đương với mấy hình do Biochemistry post không nhất thiết phải là mẫu đã qua tinh sạch.

Không có detergents trong extraction buffer vẫn thu được 1 số protein bám màng. Mà nếu có urea và NaCl thì thừa sức thu được cả những protein liên kết chặt với màng ấy chứ.
Nguyễn Phương Thảo is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 13-09-05, 22:12   #6
Trương Quốc Phong
Registered Users
Thread starter
 
Trương Quốc Phong's Avatar
 
Tham gia ngày: May 2005
Đến từ: Khoa Hóa sinh và SHPT, ĐH Bách khoa HN
Bài gửi: 21
Thanks: 0
Thanked 3 Times in 3 Posts
Như tôi đã nói,
1. Tùy thuộc vào mẫu bạn dùng để tách protein là mẫu gì, thực vật, động vật, vi khuẩn, hay cell lines,... mà bạn sẽ phải chọn phương pháp cho thích hợp. Phương pháp mà tôi muốn nói bao gồm cả quy trình tách chiết và hóa chất mà bạn cần phải dùng.
2. Tùy thuộc vào bạn sẽ định tách proteins gì, nằm ở đâu trong tế bào, hay toàn bộ proteins (total protein) mà bạn cũng cần phải chọn phương pháp thích hợp.
3. Mẫu mà tôi dùng là cả quả tim chuột, tôi quan tâm toàn bộ cytosol protein và một số protein màng (nếu có thể) nên tôi chỉ đùng đệm PBS để tách, tuy nhiên để thu được hiệu suất cao tôi dùng kết hợp cả phương pháp Đập cơ học trong điều kiện có Nitơ lỏng (tôi không dùng homogenizer) và siêu âm. Trong ảnh mà tôi đã post, giếng đầu tiên là dịch chiết thô protein, còn các giếng sau đúng là tôi đã xử lý rồi.
Tuy nhiên, không phải mẫu nào cũng cho ảnh điện di rõ ràng (như daffodil đã nói).
4. Nếu là cell lines chẳng hạn, nếu bạn không có Homogenizer, không có Sonicator, bạn chỉ có Nitơ lỏng và các detergent thích hợp bạn hoàn toàn có thể tách được cytosol protein một cách dễ dàng và hiểu quả chỉ bằng phương pháp freeze/thaw. Thậm chí, nếu có Detergent thích hợp bạn cũng không càn gì khác ngoài máy ly tâm. (tất cả những điều tôi nói ở đây là những điều mà tôi đã từng làm rồi)
5. Đối với proteins màng, đây là cả một vấn đề, để tách được protein màng cũng không dễ như daffodil đã nói là chỉ dùng Ure. Vì như chúng ta đã biết, trên màng có rất nhiều loài protein khác nhau với mức độ Kỵ nuớc khác nhau và sự tương tác của nó với protein khác trên màng cũng như các thành phần khác của màng. Do vậy mà chúng ta phải dùng đến các Detergents khác nhau và nồng độ khác nhau.
Vấn là nữa là, chúng ta tách protein nhưng lại có lẫn cả các thành phần protein khác thì điều đó chưa hẳn là mục đích của chúng ta, chúng ta muốn tách riêng thành phần protein màng ra (vì nhiều lý do tôi không muốn trình bày ở đây) lúc đó vấn đề sẽ phức tạp hơn nhiều. Chẳng hạn chúng ta phải làm sao để loại đi các protein tạp nằm bên trong lớp màng, khi lớp màng bị cuộn lại trong quá trình tách chiết (đây là một thực tế). Khi đó ta cần có các hóa chất khác nhau và các buớc thao tác khác nhau để thực hiện điều đó.
Trương Quốc Phong is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-09-05, 02:30   #7
Cao Xuân Hiếu
Administrator
 
Cao Xuân Hiếu's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2004
Đến từ: Gatersleben, Germany
Bài gửi: 1,551
Thanks: 113
Thanked 315 Times in 171 Posts
Send a message via Yahoo to Cao Xuân Hiếu
Qua thảo luận, tôi được biết biochemistvn có kiến thức khá chắc về thực nghiệm hóa sinh với các kỹ thuật đa dạng. Không biết bạn có thể cùng tham gia xây dựng SHVN bằng cách là moderator của Box Công nghệ enzim - protein được ko? Mong được sự đóng góp tích cực từ bạn.
Cao Xuân Hiếu is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-09-05, 17:22   #8
Nguyễn Phương Thảo
Registered Users
 
Nguyễn Phương Thảo's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2005
Đến từ: Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện CNSH, VAST
Bài gửi: 27
Thanks: 0
Thanked 1 Time in 1 Post
Trích:
Nguyên văn bởi Biochemistvn
5. Đối với proteins màng, đây là cả một vấn đề, để tách được protein màng cũng không dễ như daffodil đã nói là chỉ dùng Ure. Vì như chúng ta đã biết, trên màng có rất nhiều loài protein khác nhau với mức độ Kỵ nuớc khác nhau và sự tương tác của nó với protein khác trên màng cũng như các thành phần khác của màng. Do vậy mà chúng ta phải dùng đến các Detergents khác nhau và nồng độ khác nhau.
Tôi chả bao giờ nói là tách protein màng dễ và chỉ cần Urea cả :) . Tôi chỉ khẳng định lại 1 điều bạn nói ở trên là đôi khi không cần các detergent khác vẫn tách được protein bám màng. Cụ thể là tôi đã từng dùng Urea hay NaCO3 với nồng độ thích hợp để thu được protein màng (prơtein này tương tác chặt với màng) với hiệu quả không khác gì khi dùng Triton X-100.

Ảnh điện di của Biochemistry là silver staining à? Sao crude extract của bạn ít bands thế.
Nguyễn Phương Thảo is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-09-05, 17:27   #9
Nguyễn Phương Thảo
Registered Users
 
Nguyễn Phương Thảo's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2005
Đến từ: Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện CNSH, VAST
Bài gửi: 27
Thanks: 0
Thanked 1 Time in 1 Post
Trích:
Nguyên văn bởi vietbio
Qua thảo luận, tôi được biết biochemistvn có kiến thức khá chắc về thực nghiệm hóa sinh với các kỹ thuật đa dạng. Không biết bạn có thể cùng tham gia xây dựng SHVN bằng cách là moderator của Box Công nghệ enzim - protein được ko? Mong được sự đóng góp tích cực từ bạn.
Hôm nay rảnh rảnh mới đọc mấy bài trên này, vietbio có phải em H phòng chú Nông không nhỉ?
Nguyễn Phương Thảo is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 14-09-05, 18:28   #10
Cao Xuân Hiếu
Administrator
 
Cao Xuân Hiếu's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2004
Đến từ: Gatersleben, Germany
Bài gửi: 1,551
Thanks: 113
Thanked 315 Times in 171 Posts
Send a message via Yahoo to Cao Xuân Hiếu
Hì hì, tỉ tỉ chỉ cần click vào mục thông tin cá nhân là biết rùi. Em nhìn tên chị và Box chị hoạt động chủ yếu là nhận ra từ lâu rùi :)) Khi nào rảnh (mà mùa hè qua rồi) thì viết review cho em học hỏi thêm nhé.
Cao Xuân Hiếu is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến

Similar Threads
Ðề tài Người gửi Chuyên mục Trả lời Bài mới gởi
Điện di SDS PAGE protein Đặng Trịnh Minh Anh Làm thí nghiệm với protein 11 08-05-13 22:55
Điện di protein trên SDS-PAGE Nguyễn Ngọc Lương Làm thí nghiệm với protein 7 12-09-05 11:12


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2014, Jelsoft Enterprises Ltd.