Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Giảng đường > Hóa sinh

 
Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 21-03-07, 22:15   #1
Đinh Thị Thu Vân
 
Đinh Thị Thu Vân's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2006
Đến từ: Lớp HC04BSH2, Khoa CN Hóa học & Dầu khí, ĐHBK Tp.HCM
Bài gửi: 3
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Các anh chị và các bạn có thể cho mình một vài tài liệu về cách xác định hoạt tính của enzyme cellulase được không...mình đang cần mà vẫn chưa tìm được..mọi người giúp đỡ nha!!! :)
Đinh Thị Thu Vân is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 21-03-07, 23:13   #2
Lê Đoàn Thanh Lâm
Registered Users
 
Lê Đoàn Thanh Lâm's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: INRA/INSA-Toulouse, France
Bài gửi: 924
Thanks: 66
Thanked 96 Times in 55 Posts
Send a message via Yahoo to Lê Đoàn Thanh Lâm
Hoạt lực của mấy lọai enzyme thông dụng thì có từ lâu trong các protocol rồi. Ngoài ra, cái này còn tùy thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm của bạn nữa chứ, một ví dụ:
http://www.worthington-biochem.com/CEL/default.html

Hoặc bạn nhờ các cao thủ ở đây lấy cho bài sau:
http://www.springerlink.com/content/n0226g572266x55x/
Lê Đoàn Thanh Lâm is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 22-03-07, 13:06   #3
Huỳnh Như Ngọc Hiển
Registered Users
 
Huỳnh Như Ngọc Hiển's Avatar
 
Tham gia ngày: Jan 2006
Bài gửi: 945
Thanks: 97
Thanked 95 Times in 62 Posts
Bài này miễn phí không cần log in :D
Huỳnh Như Ngọc Hiển is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 23-03-07, 09:37   #4
Trần Ánh Hồng
Registered Users
 
Trần Ánh Hồng's Avatar
 
Tham gia ngày: Mar 2007
Đến từ: Lớp DH04SH, Trường Đại học Nông lâm TP.HCM
Bài gửi: 36
Thanks: 2
Thanked 6 Times in 5 Posts
Chào bạn Thu Vân .
Kiến thức của mình còn nhiều hạn chế , chỉ xin đóng góp một số ý kiến về những gì mình đã làm :
Các cơ chất dùng để xác định hoạt động phối hợp của hệ enzyme cellulase là cellulose không tan như giấy lọc , bột cellulose tinh khiết ... Tuy nhiên, lượng đường khử sinh ra không tuyến tính với lượng enzyme trong phản ứng , nghĩa là khi lượng enzyme tăng gấp đôi sẽ không sinh ra lượng đường khử gấp đôi trong cùng thời gian phản ứng (Ghose 1987).
Để khắc phục vấn đề trên , các cơ chất là dẫn xuất của cellulose tan trong nước như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) được sử dụng rộng rãi , tuy nhiên, các cơ chất này được dùng để xác định chủ yếu hoạt tính endoglucanase (CMCase hay Cx).
Ngoài ra , quá trình enzyme Cellulase thủy phân cellulose là một quá trình rất phức tạp bao gồm có sự tham gia của 3 nhóm enzyme :
- Cellulase C1 : có hoạt tính exocellulase , cắt thể cellulose thành dạng bông .
- Cellulase Cx : có hoạt tính endocellulase và exocellulase , thủy phân bên trong các cellulose thành cellobiose.
- β-glucosidase : cắt đường đôi thành đường đơn glucose.

Cellulose -------> Cellulose hoạt hóa ------------> Cellobiose ----------> Glucose .
C1 Cx β-glucosidase

Để xác định hoạt tính Cx (CMCase hay carboxymethyl cellulase) , dùng CMC (carboxymethyl cellulose) : cơ chất tác động của nó , rồi đo lượng đường nó sinh.
Trong phản ứng có enzyme , pH và nhiệt độ là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
Trong thí nghiệm này, hoạt tính enzyme CMCase được xác định theo phương pháp của công ty Shin Nihon Chemical Co.,Ltd.

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME CMCase.

Mục đích : Biết được mức độ ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme .
Xác định được điểm pH tối ưu mà enzyme hoạt động mạnh nhất.
Qua đó, có kế hoạch thiết lập điều kiện phản ứng thích hợ p để thu được hiệu quả năng suất cao .

I/ NGUYÊN TẮC :
- Dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bởi enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ở các pH chạy từ : 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 trong khi giữ nguyên nhiệt độ 400C cố định.
- Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS).
- Màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm.

II/ CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :

Chuẩn bị 11 ống nghiệm như sau :

Ống Ống Đối chứng mẫu Ống Thí nghiệm
Đối chứng 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Nước Dung dịch Enzyme đun sôi 5 phút Dung dịch Enzyme
1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Thuốc thử DNS Thuốc thử DNS CMC pH =4 CMC pH=4,5 CMC pH=5 CMC pH=5,5 CMC pH=6
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
ủ ở 400C , thời gian : 10 phút
CMCpH=5 CMCpH=4 CMCpH=4,5 CMCpH=5 CMCpH=5,5 CMC pH=6 Thuốc thử DNS
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Sau đó , đem đun sôi tất cả trong 15 phút , để nguội rồi đo mật độ quang OD ở bước sóng 540 nm

LÝ GIẢI VÀ THẢO LUẬN:
1.Lý giải.
-Ống đối chứng : để chỉnh quang phổ kế về độ hấp thu bằng 0
-Ống đối chứng mẫu : không có phản ứng enzyme do đã đun sôi 5 phút để diệt enzyme.
-Ống thí nghiệm : có phản ứng enzyme .
-Đun sôi cách thủy 15 phút để ngừng phản ứng enzyme.
-Đo quang phổ kế ở bước sóng 540 nm vì ở bước sóng này , lượng đường Glucose sinh ra được hấp thụ với DNS.
2.Thảo luận :
-Dựa vào kết quả : ở pH = 4,5 thì hoạt tính enzyme cao nhất do lượng đường khử sinh ra phản ứng với DNS nhiều nhất ( 0,169 ).Vậy pH= 4,5 là pH tối ưu của enzyme.
-Cơ chế về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme:
 Nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó , vận tốc phản ứng của enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại.
 pH tối ưu cho hoạt động của enzyme : giá trị pH mà ở đó vận tốc enzyme đạt cực đại.
 Vượt qua pH tối ưu , hoạt động enzyme sẽ giảm.
 Mỗi loại enzyme có khoảng pH và điểm pH tối ưu đặc trưng.
 pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của protein , trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES.
 Đặc tính này có ý nghĩa trong việc làm tăng , giảm hay triệt tiêu phản ứng enzyme , trong các quá trình bảo quản và chế biến lương thực thực phẩm , việc ứng dụng enzyme vào sản xuất các chất tẩy rửa , trong công nghiệp nhẹ và y học

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME CMCase

Mục đích : Biết được mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme .
Xác định được điểm nhiệt độ tối ưu mà enzyme hoạt động mạnh nhất.
Qua đó, có kế hoạch thiết lập điều kiện phản ứng thích hợ p để thu được hiệu quả năng suất cao .

I/ NGUYÊN TẮC :
- Dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bởi enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ở pH = 5 cố định trong khi nhiệt độ thay đổi như sau : nhiệt độ phòng (300C) , 400C , 500C , 600C , 700C .
- Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS).
- Màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm.

II/ CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :

Chuẩn bị 11 ống nghiệm như sau :

Ống Ống Đối chứng mẫu Ống Thí nghiệm
Đối chứng 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

H2O Dung dịch Enzyme đun sôi 5 phút Dung dịch Enzyme
1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Thuốc thử Thuốc thử DNS CMC pH = 5
DNS
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Để ở Ủ ở 400C, ủ ở 500C, ủ ở 600C, ủ ở 700C
thời gian
nhiệt độ thời gian : thời gian thời gian 10 phút
phòng 10 phút 10 phút 10 phút
(300C),
thời gian :
10 phút CMC pH=5 CMC pH = 5 Thuốc thử DNS
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Sau đó , đem đun sôi tất cả trong 15 phút , để nguội rồi đo mật độ quang OD ở bước sóng 540 nm

LÝ GIẢI VÀ THẢO LUẬN:
1.Lý giải.
-Ống đối chứng : để chỉnh quang phổ kế về độ hấp thu bằng 0
-Ống đối chứng mẫu : không có phản ứng enzyme do đã đun sôi 5 phút để diệt enzyme.
-Ống thí nghiệm : có phản ứng enzyme .
-Đun sôi cách thủy 15 phút để ngừng phản ứng enzyme.
-Đo quang phổ kế ở bước sóng 540 nm vì ở bước sóng này , lượng đường Glucose sinh ra được hấp thụ với DNS.
2.Thảo luận :
-Dựa vào kết quả : ở nhiệt độ 500C thì hoạt tính enzyme cao nhất do lượng đường khử sinh ra phản ứng với DNS nhiều nhất (0,048).Vậy 500C là nhiệt độ tối ưu của enzyme.
-Cơ chế về ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme:
 Nhiệt độ càng tăng , tốc độ phản ứng và khả năng xúc tác của enzyme càng tăng.
 Khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định , quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh.
 Hiện tượng này do bản chất hóa học của enzyme .
 Các enzyme là những protein thường không bền nhiệt.
 Tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất.
 Vượt quá giới hạn nhiệt độ , cấu trúc không gian của enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa , khi đó , hoạt tính enzyme sẽ mất dần và triệt tiêu.
 Biện pháp dùng nhiệt độ làm tăng khả năng hoạt động của enzyme có ý nghĩa trong kỹ thuật và cả trong bảo quản chế biến thực phẩm

Đây là các quá trình mà mình đã làm, nếu bạn thấy khó hiểu chỗ nào thì hỏi lại .
Get fun ^_^
Ah, sẵn cho mình hỏi thăm : ở trường, bạn này có được học thầy Lượng hay Lương không ? (mình không nhớ rõ tên lắm) . Nghe nói thầy chuyên về các ứng dụng của CNSH trong chế biến thực phẩm , mà mình rất quan tâm đến lĩnh vực này, nên muốn tìm hiểu thêm ^_^
Thanks
Trần Ánh Hồng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Thanked by
Old 31-07-13, 00:15   #5
mỹ xuyên
Registered Users
 
mỹ xuyên's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2013
Bài gửi: 1
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
chị hồng còn lưu lại bài nà nữa không
nếu có chị gử cho em được không
mail của em là myxuyenbq@gmail.com
mỹ xuyên is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2014, Jelsoft Enterprises Ltd.